《国际检验医学杂志》首发了《淋巴细胞功能流式细胞术检测专家共识》。针对当前流式细胞术检测多局限于淋巴细胞亚群数量与比例，且存在操作流程不统一、质控体系缺失及临床应用受限等问题，本共识由中国中西医结合学会检验医学专业委员会牵头制定。共识重点规范了NK细胞杀伤功能、胞内IFN-γ及Th1/Th2/Th17水平等关键检测技术的标准流程与质量控制要求。其旨在通过统一技术标准，显著提升检测的准确性与可重复性，为淋巴细胞功能检测在疾病诊疗及科学研究中的规范化应用提供权威指导。
三大检测方向的标准化路径
本共识聚焦常用淋巴细胞功能检测，提供具体可操作的技术方案，为仪器与试剂的规范化应用确立明确依据。
NK细胞杀伤功能FCM检测
NK细胞杀伤功能检测主要评估其细胞毒活性。相比传统方法，流式细胞术因安全、多参数及便捷成为主流。该法利用全血标本与K562靶细胞共培养4小时，基于K562缺乏MHC-Ⅰ分子且NK细胞具“missing-self”识别机制，确保检测到的靶细胞死亡主要由NK细胞介导。此方案能有效评估机体NK细胞功能，在噬血细胞综合征、肿瘤及病毒感染等疾病的诊疗中具有重要应用价值。
具体步骤如下：
- 试剂与细胞准备：推荐使用Annexin V/7-AAD进行凋亡染色，并采用EGFP稳定转染的K562细胞作为靶细胞以提升灵敏度。
- 样本处理：提取新鲜抗凝全血中的PBMCs，经密度梯度离心分离、洗涤后，用含血清培养液重悬至5×10⁶/mL；同时将靶细胞调整至5×10⁵/mL，确保活力大于95%。
- 共培养体系：按效靶比10:1混合效应细胞与靶细胞（各100μL），设培养基对照孔，于37℃、5% CO₂条件下共培养4小时。
- 检测与分析：收集细胞进行Annexin V/7-AAD染色。流式分析时先圈选EGFP+靶细胞群，再统计其凋亡及死亡比例。
- 结果计算：NK细胞杀伤活性等于样本孔靶细胞阳性率减去背景自然凋亡率。该指标对HLH诊断、肿瘤及免疫疾病评估具有关键价值。
共识：本共识强推荐采用Annexin V/7-AAD双染法结合EGFP-K562靶细胞，通过流式细胞术评估NK细胞杀伤功能。实验需提取高活力PBMCs与靶细胞（成活率>95%），按效靶比共培养4小时，获取至少10,000个靶细胞进行分析。结果以样本组与对照组靶细胞凋亡比例之差报告。临床意义上，NK活性增高见于病毒感染早期、习惯性流产等；活性降低或缺如不仅是噬血细胞综合征（HLH）的关键诊断标准，也常见于恶性肿瘤、免疫缺陷及长期使用免疫抑制剂患者，对疾病诊疗具有重要指导价值。
淋巴细胞细胞内IFN-γ的FCM检测
本共识推荐基于全血标本，利用流式细胞术检测淋巴细胞胞内IFN-γ。该方法通过体外刺激评估T细胞产生IFN-γ的能力及Th1型分化潜能，虽不等同于体内即时水平，但能间接反映机体细胞免疫系统的功能状态与应答能力，在肿瘤、感染等疾病的临床评估中具有重要价值。
本共识推荐采用6色及以上流式方案，抗体组合须涵盖CD3、CD4、CD8、CD16/56、CD45及IFN-γ（优选高信噪比的PE或APC荧光）。
详细实验操作流程如下：
- 样本前处理：采集新鲜抗凝全血（EDTA或肝素），可直接进行红细胞裂解处理，或通过密度梯度离心分离提取PBMCs，重悬备用。
- 体外刺激诱导：因静息细胞因子表达极低，需在检测管中加入特异性刺激剂（PMA联合离子霉素）及蛋白分泌抑制剂（布雷非德菌素A）。将样本置于37℃、5% CO₂培养箱中严格孵育4小时，以充分激活T细胞与NK细胞并阻断胞内蛋白分泌。
- 表面抗原染色：收集细胞，加入含CD45、CD3、CD4、CD8、CD16/56的抗体混合液，避光室温孵育完成膜表面标记。
- 固定与破膜：使用专用固定液固定细胞，随即加入破膜剂破坏细胞膜通透性，为胞内染色做准备。
- 胞内因子染色：在破膜体系中加入IFN-γ荧光抗体，避光孵育完成后洗涤上机。
- 数据分析：采用“SSClow/CD45+”圈定淋巴细胞门，逐级细分出CD4+ T、CD8+ T及NK细胞亚群，分别统计各群中IFN-γ阳性细胞比例，以精准评估机体细胞免疫应答状态。
共识：本共识强推荐采用6色及以上流式方案，抗体组合须含CD3、CD4、CD8、CD16/56、CD45及IFN-γ（优选PE或APC）。实验需利用PMA联合离子霉素刺激细胞，于37℃、5% CO₂孵育4小时以诱导胞内因子表达，随后按标准流程进行固定破膜及染色。结果应分别报告CTL（CD8+T）与NK细胞中IFN-γ的阳性比例。该检测能精准评估各亚群功能：CD4+T反映Th1应答，CD8+T体现杀伤效应，NK细胞代表先天免疫活化水平。其在肿瘤、感染、免疫缺陷及移植等领域的疾病监测与疗效评估中具有重要临床价值。
体外刺激的Th1/Th2/Th17的FCM检测
本共识推荐基于全血，通过体外刺激检测CD4+T细胞内IFN-γ、IL-4及IL-17，以评估Th1/Th2/Th17分化潜能与功能储备。该方法侧重反映细胞在统一刺激下的功能反应性与可塑性，不同于检测表面标志物的表型分型（即时分布），两者分别从功能状态与即时分布维度互补评价免疫状态。
本共识强推荐采用6色及以上流式方案，抗体组合须含CD3、CD4、CD45及胞内因子IFN-γ、IL-4、IL-17（优选PE、APC、FITC等高信噪比荧光素）。
详细实验操作流程如下：
样本准备与刺激：采集新鲜抗凝全血（建议2h内处理）或分离PBMCs。每管加入含PMA（终浓度50 ng/mL）、离子霉素（1 μg/mL）及蛋白转运抑制剂BFA（10 μg/mL）的刺激混合液。置于37℃、5% CO₂培养箱严格孵育4小时，以激活细胞并阻断因子外排。
- 表面抗原染色：取刺激后样本，加入抗CD3、CD4、CD45单抗，室温避光孵育15-20分钟。
- 固定与破膜：加入红细胞裂解液（若为全血）裂解红细胞，洗涤后加入固定液固定细胞（室温15-20分钟）。离心弃上清，加入破膜剂重悬细胞，室温孵育10-15分钟以增加膜通透性。
- 胞内因子染色：在破膜缓冲体系中，加入抗IFN-γ、IL-4、IL-17荧光抗体，室温避光孵育30分钟。
- 洗涤与检测：用破膜缓冲液洗涤2次，去除未结合抗体，最后用鞘液重悬细胞，1小时内上机检测。
- 数据分析：依“SSClow/CD45+”圈定淋巴细胞，逐级筛选CD3+CD4+T细胞群，统计各因子阳性比例及Th1/Th2比值。
- 该流程旨在精准评估CD4+T细胞的功能储备与分化潜能。
本共识强推荐采用≥6色方案，检测CD3/CD4/CD45及胞内IFN-γ、IL-4、IL-17（优选高信噪比荧光素）。经体外刺激后，以CD3+CD4+各因子阳性细胞定义Th1/Th2/Th17功能亚群，报告其占CD4+比例及Th1/Th2比值。该指标反映免疫偏向，需结合临床综合解读。
质量控制要点
检测需严格质控：样本宜采10mL新鲜外周血，2h内分离PBMCs；分离液预热至室温，规范加样以保界面清晰。刺激剂（PMA/离子霉素/BFA）需分装-20℃保存，避免反复冻融。实验室应建立针对全血裂解与PBMCs的独立参考区间，符合WS/T 402标准并定期验证。须制定涵盖全流程的SOP，加强人员培训与室间比对以弥补质评缺失。结果解读应结合病史、指南及动态趋势，综合评估患者免疫状态。
共识：鉴于检测流程复杂且缺乏统一参考区间，强推荐实验室严格规范操作细节，建立并验证本地参考范围，实施全流程标准化质控。结果解读须紧密结合患者病史、指南及诊疗标准进行综合评估，以确保临床准确性。
总结
本共识规范淋巴细胞功能检测，针对标准化难题，呼吁完善质控体系并开展多中心研究，以提升临床应用价值。菲恩生物提供专业流式配色方案与高品质抗体，优化淋巴细胞功能检测（如NK杀伤、胞内因子及Th亚群分析），提升多色检测灵敏度与准确性，助力免疫、肿瘤及自身免疫病研究，诚邀合作共促创新！
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| 货号 | 产品名称 | 规格 |
| K073 | Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Kit | 20T/50T/100T |
| K072 | Annexin V-APC/7-AAD Apoptosis Kit | 20T/50T/100T |
| K082R | 胞内因子固定破膜剂（即用型） | 50T/100T/500T |
| K083 | 细胞因子激活和蛋白阻断试剂盒 | 50T/100T/200T |
| K080 | 10×红细胞裂解液（不含固定剂） | 100mL/200mL/500mL |
| K079 | 细胞染色缓冲液 | 100mL/200mL/500mL |
| 种属 | 细胞群 | 流式抗体搭配 | 货号 |
| Human | T/B/NK细胞群检测 | CD45-PerCP | PCP-30039 |
| CD3-FITC | FITC-30004 | ||
| CD16-PE | PE-30061 | ||
| CD56-PE | PE-30008 | ||
| CD19-APC | APC-30066 | ||
| Human | Th1/Th2 细胞群检测 | CD3-PerCP-Cy5.5 | PCP55-30004 |
| CD4-FITC | FITC-30005 | ||
| IFN-γ-PE | PE-30053 | ||
| IL4-APC | APC-30043 | ||
| Mouse | Th1/Th2 细胞群检测 | CD3-PerCP-Cy5.5 | PCP55-30002 |
| CD4-FITC | FITC-30128 | ||
| IFN-γ-PE | PE-30074 | ||
| IL4-APC | APC-30026 | ||
| Human | Treg细胞群检测 | CD4-FITC | FITC-30005 |
| CD25-PE | PE-30035 | ||
| CD3-PerCP-Cy5.5 | PCP55-30004 | ||
| CD127-FineTest®647 | F647-30033 | ||
| Mouse | Treg细胞群检测 | CD4-FITC | FITC-30128 |
| CD25-APC | APC-30017 | ||
| FOXP3-PE | PE-30111 |