流式细胞术是目前最先进的细胞定量分析技术，具备高特异性、高灵敏度和快速多参数检测的优势，广泛应用于白血病、淋巴瘤的免疫分型及造血干细胞移植疗效评估等临床领域。其中，细胞免疫表型分析是其核心应用之一，通常包括单细胞悬液制备、细胞表面染色，以及根据需要进行的胞内或核内抗原（如转录因子、细胞因子）染色。本期将重点介绍流式实验中抗体染色的具体操作流程与关键注意事项。
一、免疫细胞流式适用的检测项目
免疫细胞流式检测广泛应用于科研与临床，主要涵盖以下几类项目：
1.基础淋巴细胞亚群分析
包括T细胞（CD3⁺CD4⁺/CD8⁺）、B细胞（CD19⁺/CD20⁺）和NK细胞（CD3⁻CD56⁺/CD16⁺），用于评估免疫稳态、HIV/AIDS监测及免疫缺陷筛查。
2.T/B细胞功能亚群分型
如Th1/Th2/Th17/Treg（通过T-bet/GATA3/RORγt/Foxp3等转录因子或细胞因子鉴定）、记忆B细胞（IgD/CD27组合）及浆母细胞（CD38ʰⁱCD27ʰⁱ），有助于解析自身免疫病、感染或疫苗应答机制。
3.活化、耗竭与增殖状态评估
检测活化标志（CD25、HLA-DR）、免疫检查点（PD-1、TIM-3、LAG-3）及增殖指标（Ki-67、CFSE），在肿瘤免疫治疗中尤为重要。
4.细胞因子与凋亡分析
通过胞内染色检测IFN-γ、IL-17等分泌谱，或采用Annexin V/PI评估细胞凋亡。
5.临床专项应用
包括白血病/淋巴瘤免疫分型、κ/λ轻链限制性分析（判断B细胞克隆性）、CAR-T细胞监测及原发性免疫缺陷病诊断。
多色流式技术可实现高维、精准的单细胞水平分析，为疾病机制研究、诊断分型及疗效评估提供关键支持。
二、具体操作步骤
1.表面抗体染色
流式细胞术样本处理分为细胞悬液和全血两类。细胞悬液需调整浓度至1×10⁷ cells/mL，取100 μL加入表面抗体，2-8℃避光孵育30分钟；随后加1–2 mL染色缓冲液，300 ×g 离心5分钟，弃上清，用200 μL缓冲液重悬后上机。抗凝全血（人100 μL，小鼠30–50 μL）可直接加抗体同法孵育，再按说明书加入红细胞裂解液去除红细胞，离心洗涤后同样用200 μL缓冲液重悬检测。
2.胞内抗体染色
以菲恩生物胞内因子固定破膜剂（即用型）-货号：K082R为例。
进行胞内抗原流式检测时，取约1×10⁶个细胞（100 μL）于流式管中，可选进行死活染色及Fc受体封闭，随后加入荧光标记抗体染色细胞表面标志物。孵育后用1 mL含1% BSA的PBS重悬，300×g离心5分钟弃上清；再用200 µL含1% BSA的PBS重悬，加入等体积Fixation Buffer，室温避光固定30–60分钟（低于25°C建议延长至60分钟），600×g离心弃上清。接着用1 mL含1% BSA的PBS洗涤一次，此步可暂停并将细胞4℃保存过夜。次日离心后，加入100 µL Permeabilization Buffer重悬细胞，加入胞内染色抗体，室温避光孵育30分钟即可进行后续检测。
3.核内抗体染色
以菲恩生物Foxp3/转录因子染色固定&破膜试剂盒-货号：K081为例。
使用FoxP3/转录因子染色缓冲液试剂盒可同时检测胞浆与核内蛋白。取约1×10⁶个细胞（100 μL）置于流式管中，可选进行Fixable Viability Dye染色以区分死活细胞，并根据需要封闭Fc受体。随后加入荧光标记的表面抗体，避光孵育。孵育结束后，加入1 mL细胞染色缓冲液[K079]，300×g离心5分钟，弃上清，用100 μL缓冲液重悬。接着加入1 mL 1×Fixation Working Solution，涡旋混匀，4℃固定30分钟，600×g离心5分钟弃上清。再用2 mL 1×Permeabilization Working Buffer洗涤两次（每次600×g离心5分钟），最后用100 μL该缓冲液重悬细胞，加入荧光标记的核内抗体，室温避光孵育30分钟。孵育后再次用Permeabilization Buffer洗涤，最终用适量缓冲液（菲恩生物：K079）重悬，即可上机检测。
菲恩生物专注于提供专业的流式配色设计服务与高品质检测试剂，科学优化多色抗体组合方案，有效减少荧光重叠与背景干扰，显著提升检测的特异性与灵敏度。通过精准识别和分选目标免疫细胞群体，助力科研人员获得高效、稳定、可靠的数据，广泛支持免疫学、肿瘤免疫及自身免疫疾病等前沿领域的研究。欢迎咨询合作，共促科研创新与发展！
以下是菲恩生物推荐的流式抗体搭配方案
| 流式抗体推荐 | |||
| 种属 | 细胞群 | 流式抗体搭配 | 货号 |
| Human | T/B/NK细胞群检测 | CD45-PerCP | PCP-30039 |
| CD3-FITC | FITC-30004 | ||
| CD16-PE | PE-30061 | ||
| CD56-PE | PE-30008 | ||
| CD19-APC | APC-30066 | ||
| Human | Th1/Th2 细胞群检测 | CD3-PerCP-Cy5.5 | PCP55-30004 |
| CD4-FITC | FITC-30005 | ||
| IFN-γ-PE | PE-30053 | ||
| IL4-APC | APC-30043 | ||
| Mouse | Th1/Th2 细胞群检测 | CD3-PerCP-Cy5.5 | PCP55-30002 |
| CD4-FITC | FITC-30128 | ||
| IFN-γ-PE | PE-30074 | ||
| IL4-APC | APC-30026 | ||
| Human | Treg细胞群检测 | CD4-FITC | FITC-30005 |
| CD25-PE | PE-30035 | ||
| CD3-PerCP-Cy5.5 | PCP55-30004 | ||
| CD127-FineTest®647 | F647-30033 | ||
| Mouse | Treg细胞群检测 | CD4-FITC | FITC-30128 |
| CD25-APC | APC-30017 | ||
| FOXP3-PE | PE-30111 | ||