造血干细胞（HSCs）是主要定居于骨髓的多能干细胞，具备长期自我更新能力，并可分化为所有类型的成熟血细胞。其分化路径首先形成两大祖细胞：共同淋巴祖细胞（CLPs）和共同髓系祖细胞（CMPs）。CLPs进一步发育为T细胞、B细胞和自然杀伤（NK）细胞；而CMPs则分化为单核/巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、红细胞、巨核细胞（生成血小板）以及部分树突状细胞，共同构成机体的免疫与血液系统。
一、造血干细胞的来源与功能
造血干细胞（HSCs）主要有三大来源：骨髓、外周血和脐带血。传统上，骨髓（如股骨、胸骨、肋骨）是HSC的主要来源并广泛用于移植；脐带血中HSC浓度约为骨髓的10倍，具有增殖能力强、免疫相容性好、排斥风险低等优势；外周血经动员后也可采集足够数量的HSC用于移植。在白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等疾病治疗中，输注的HSC可归巢至骨髓，重建造血与免疫系统，即使少量移植也能每日生成数十亿新血细胞，有效恢复患者血液功能。
二、造血干祖细胞分选常用标志物
人与小鼠造血干祖细胞（HSPC）的分选标志物存在显著种属差异。人造血干细胞主要依赖CD34⁺CD38⁻表型，原始长期造血干细胞（LT-HSC）通常为CD34⁺CD38⁻CD90⁺CD45RA⁻，并可结合ALDH高活性进一步富集；CD34在骨髓、脐带血和外周血中表达频率分别为1–5%、1%和0.1%。小鼠HSPC则以Lin⁻c-Kit⁺Sca-1⁺（KSL）为核心策略，其LT-HSC多为CD34⁻Flk2⁻（CD135⁻），且Sca-1在C57BL/6等品系有效，而在BALB/c中表达较低；替代方案采用SLAM标志物（Lin⁻CD48⁻CD150⁺）可跨品系适用。此外，小鼠HSC还可通过CD201⁺CD34⁻CD135⁻或低摄取Hoechst/Rh123（侧群特性）进一步富集。这些差异反映了物种演化对表面抗原表达的影响，对实验设计和跨物种研究具有重要意义。
三、技术核心：FACS与表面标记的组合策略
本研究利用流式细胞分选技术，结合多种特异性表面抗体，对造血干细胞（HSCs）和多能祖细胞（MPPs）进行层级化识别与分离。关键标志物包括：CD34（干祖细胞通用标记）、CD38（HSCs呈阴性或低表达）、CD45RA（阴性以富集未分化HSCs），以及CD90（Thy1）和CD49f（整合素α6），用于进一步提升长期造血干细胞（LT-HSCs）的纯度。最终目标群体被精确定义为 lin⁻CD34⁺CD38⁻/lowCD45RA⁻CD90⁺CD49f⁺，实现高纯度LT-HSCs的分离。
四、实验流程详解：从样本到纯化细胞
以下为论文中描述的全套操作流程，适用于从外周血动员后白细胞采集产物（mob LPs）中分离造血干细胞（HSCs）和多能祖细胞（MPPs）：
1.单个核细胞（PBMC）的分离
- 采用密度为1.077 g/mL的Pancoll进行密度梯度离心。
- 将稀释后的白细胞样本轻柔叠加于Pancoll上层，400×g离心30分钟（室温，无刹车）。
- 收集界面处PBMCs，用PBS洗涤两次（200×g，10分钟，20°C），以去除残留血小板。
2.CD34⁺细胞的磁珠分选（MACS）
- 使用CD34 MicroBeads UltraPure试剂标记PBMCs，4°C孵育30分钟。
- 经70 μm滤网过滤后，通过LS柱在QuadroMACS分离器上正向分选，收集CD34⁺细胞。
3.抗体染色：分步进行
①生物素标记谱系抗体染色（用于去除非目标成熟细胞）
抗体组合包括CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD56、CD235a；每5×10⁶细胞加入指定量抗体，4°C避光孵育15分钟；PBS洗涤后重悬于细胞染色缓冲液（K079）。
②荧光标记抗体染色
抗体组合（每5×10⁶细胞）：eF510（2 μL）、CD45RA-BV450（5 μL）、CD90-PerCP-Cy5.5（5 μL）、CD49f-PE-Cy5.5（2.5 μL）、CD34-APC（2.5 μL）、CD38-red 780（5 μL）；冰上避光孵育30分钟，PBS洗涤后重悬于MACS缓冲液。
4.设置对照样本
FMO（荧光减一）对照用于设门参考；单标对照（补偿微球或阳性细胞）用于流式光谱补偿校正。
5.FACS分选设置与执行
- 使用70 μm喷嘴，优化滴延迟与断点。
- 以未染色细胞调整PMT电压。
- 设门策略依次为：排除碎片（FSC-A vs SSC-A）→ 排除双联体（FSC-A vs FSC-H）→ 活细胞（eF506⁻）→ 谱系阴性（lin⁻）→ CD34⁺CD38⁻/low → CD45RA⁻ → 按CD90和CD49f表达细分。
- 最终分选出四个群体：LT-HSCs（lin⁻CD34⁺CD38⁻CD45RA⁻CD90⁺CD49f⁺）及三类MPP亚群。
6.分选后验证
- 采用“纯度模式”重新分析分选产物，要求纯度 >95%。
- 分选细胞立即用于下游功能实验，以维持其生物学活性。
五、总结
本研究揭示HSC“纯化≠绝对纯净”，其异质性及NSG小鼠模型局限亟需单细胞多组学（如CITE-seq）深入解析。菲恩生物提供专业流式配色设计与高质检测试剂，优化多色方案，降低干扰，提升检测精准度，助力免疫细胞精细分选，赋能免疫学、肿瘤免疫及自身免疫疾病研究。欢迎合作，共促创新！
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| 货号 | 产品名称 |
| K124 | FineTest® Violet510 (死活染料) |
| FV450-30153 | FineTest® Violet 450 Anti-Human CD45RA Antibody(HI100) |
| PCP55-30069 | PerCP-Cy5.5 Anti-Human CD90 Antibody(5E10) |
| APC-30071 | APC Anti-Human CD34(581) |
| FR780-30238 | FineTest® Red 780 Anti-Human CD38 Antibody(AT13/5) |