免疫组化常见问题及解决方案
做过免疫组化的人都知道，实验看似容易，但真想把结果做漂亮，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。今天就来给大家分享下免疫组化实验中会会遇到的问题以及经验总结。
一．一抗如何选择？
1.单克隆和多克隆抗体的选择：存在于抗原表面的，决定抗原特异性的特殊化学基团称为抗原决定簇，又称抗原表位。一个抗原可以有一种或多种不同的抗原表位，每种表位只有一种抗原特异性。
用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的抗体，就是多克隆抗体(polyclonalantibody,pAb)。由单一B细胞克隆产生的识别一种抗原表位的抗体，称为单克隆抗体(monoclonalantibodies,mAb)。
在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，切片和细胞染色产生的背景信号更少，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，因为不依赖单一表位，因此其对微小抗原变化(例如多态性、糖基化异质性或者轻微变性)的包容性更强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等避免)。
2.应用范围的选择：有的一抗只能用于WB(Westernblotting)或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等，必须选择能做免疫组化的抗体。
3.适用种属的选择：这一点很重要，你的目的是检测哪个种属样本，就必须选择能检测该种属的抗体，因为抗体在不同种属间存在差异。
4.宿主来源：一般兔来源的多是多克隆，也有兔单克隆；而小鼠来源的多是单克隆。需要根据一抗宿主来源来选择相应的二抗。
二、石蜡切片和冰冻切片的区别是什么？
1.冰冻切片常用于手术中的快速病理诊断，优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。
2.石蜡切片广泛应用于常规制片，优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温长久保存。缺点是步骤繁多，需要抗原修复。
3.抗体应用中能做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，因为石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是能做石蜡切片的，可同时做冰冻切片。
三、如何才能充分脱蜡？
1.蜡不溶于水，如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起染色不均匀、背景染色增加等。为了解决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短；
2.脱蜡的时间要灵活调整。如果在夏天，室温较高，则脱蜡时间不需很多，3-5min就已足够。如果在冬天，室温较低，则脱蜡时间需要延长，10-20min或更长。
3.当天切的切片，烤2小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温10-20min，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果会更好。原则上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。
三、在什么情况下使用Triton X-100？
1.Triton X-100是一种去污剂。在免疫组织化学(10μm以上厚切片)和免疫细胞化学中一般用Triton X-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。
2.其作用原理：Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
3.Triton X-100既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用。
四、内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？
1.一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以避光10min；而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10-30min。
2.用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS好，能更好保护抗原和固定组织，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片。
3.现用现配，配好后4℃避光保存。
五、抗原修复的条件怎么选择？
1.抗原修复是针对石蜡包埋的切片的必要步骤，大多数甲醛固定的组织在开始染色前都要先修复抗原，这是由于在固定过程中产生了亚甲基桥使蛋白之间交联屏蔽了抗原位点。
2.常用的两种方法为热修复法(HIER)和酶解法。推荐两种常用的热修复缓冲液：pH6.0，10mM柠檬酸盐缓冲液和pH9.0，0.5mMTris-EDTA缓冲液。具体使用哪种缓冲液可以参考您的抗体说明书，通常来讲，EDTA缓冲液适合多数磷酸化酪氨酸特异性抗体，而柠檬酸盐缓冲液则适用于其他多数抗体。
3.微波加热修复为实验室常用修复方法。
六、封闭血清的选择原则是什么？
1.切片上有一些空余的地方可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性，必须要进行封闭后才能进行一抗孵育。
2.封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。
3.也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
七、抗体孵育条件的比较？
1.一抗孵育温度有几种：4℃、室温、37℃，其中4℃过夜效果最佳；
2.孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37℃ 1-2h，4℃过夜
3.二抗一般室温或37℃ 30min-1h
八、DAB显色时间如何把握？
1.DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗。
2.DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间。
3.若很短时间就出现背景很深，还有可能是你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间。
4.DAB显色时间很长(如超过十几分钟)才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短(最好一抗4℃过夜)；另一方面就是封闭时间过长。
九、苏木素复染时间如何把握？
1.苏木素复染时间要根据温度，试剂新旧和目标物的定位变动，一般数秒-数分钟。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。对于细胞核定位的指标，减少苏木素染色时间。
2.盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒(动作一定要快)后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。
3.如果分化的颜色过浅，可以复置于苏木素中染色。
十、背景染色较深的原因有哪些？
1.抗体浓度过高：一抗浓度或二抗浓度高是常见的原因。
解决办法：每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，找到适合自己样本的工作浓度，不能只简单的按说明书进行染色。
2.抗体孵育时间过长或温度较高：
解决办法：严格执行操作规程，计时器计时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。
3.DAB变质和显色时间太长
DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
4.组织变干
修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，用免疫组化笔在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。
5.一抗质量不好
注意：抗体的有效期，过期的抗体要么不显色要么背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照。