信号增强系列 - 武汉菲恩生物科技有限公司

多聚酶二抗

过氧化物酶标记的抗体方法于1968年推出，是大多数临床和研究中石蜡包埋组织抗体的首次实践应用（Nakane,1968）。然而常规的二抗-HRP结合物每个IgG分子上最多能结合3个HRP分子。这种结合物的分子量能满足常规的WB和Elisa实验要求，但在检测目标蛋白分子量含量很低时，如果不通过额外的步骤来放大信号，会降低检测靶标所需的灵敏度。IHC实验时尤为明显。

在过去的几十年中，IHC实验用试剂和实验方案上的改进增加了这套检测系统的灵敏度。基于酶-抗-酶免疫复合物技术(PAP和APAAP)( Sternberger et al., 1970)和标准的抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白-生物素-复合物技术(ABC或SABC)以及标记的链霉素-生物素(LSAB)技术，再通过多聚酶结合，这种新方法使检测抗原的能力比之前提高好几倍。

然而PAP和APAAP方法会形成巨大的骨架结构导致检测物质体积过大而容易发生遮蔽和位阻现象（如细胞核抗原的检测），使其难以进入到组织样品内部而导致灵敏度降低(for review see: Shi et al., 1999 and citations therein)。

人体内很多组织分布有生物素(维生素H)，它可以和ABC/SABC结合产生非特异性染色。同时为了减少实验步骤，加强信号，需要一种容易渗透到组织内部，降低非特异反应，并能提高信号强度的检测系统来代替传统的方法。

各检测系统的差异

FineTest®IHC Kits 采用了一种新的多聚酶二抗系统（包括 poly-HRP 羊抗兔 IgG 和 poly-HRP 羊抗小鼠 IgG）。更多的酶可以通过链接臂结构链接到单分子的抗体上，形成最合适的复合物结构，从而在免疫组化实验中提高信号强度，同时简化了实验程序。

各检测系统的差异：

Amplification system	Size	Components	The experimental steps	Signal
PAP,APAAP	Very large＞5000kd	Anti-HRP-IgG HRP HRP-IgG	1.primary antibody 2.PAP or APAAP	Medium
ABC(SABC)	Large＞2000kd	Avidin(Streptavidin) Biotin-HRP	1.primary antibody 2.biotin-secondary antibody 3.ABC(SABC)	Strong
Poly-HRP-IgG	Medium:700~1200kd	HRP(multiple)-IgG (secondary antibody)	1.primary antibody 2.secondary antibody	Very strong
HRP-IgG(normal)	Small:200~282kd	HRP(1-3)-IgG (secondary antibody)	1.primary antibody 2.secondary antibody	Weak or none

显色对比试验


abcam（ab209101）多聚酶二抗，DAB显色1分钟	FineTest^®多聚酶二抗，DAB显色1分钟	市面常见的商品化产品，SABC显色1分钟	FineTest^®多聚酶二抗，DAB显色1分钟

原理示意图：

IHC 测试结果

分别进行了高浓度和低浓度的目标抗原 IHC 实验。其中一抗，多聚酶二抗和 DAB 试剂盒均来自FineTest®

较高浓度的目标抗原：

抗体	稀释比	定位	货号
Histone H3.3^(A)	1:150	Nucleus	FNab03888
PCNA^(B)	1:200	Nucleus	FNab06216
a-Tubulin^(C)	1:300	Cytoplasm, Cytoskeleton	FNab00333
GAPDH^(D)	1:500	Cytoplasm, Nucleus	FNab03342
Lamin A/C^(E)	1:400	Nucleus	FNab04681
VDAC1^(F)	1:400	Cell membrane, tochondrion	FNab09826
β-actin(monoclonal)^(G)	1:250	Cytoplasm, Cytoskeleton	FNab00873

较低浓度的目标抗原：

抗体	稀释比	定位	货号
TRX- 1^(H)	1:300	Cytoplasm, Nucleus	FNab09033
PXMP2^(I)	1:150	Peroxisome membrane	FNab06965
TTK^(J)	1:200	Cytoskeleton	FNab09094
MEK3^(K)	1:300	Cytoplasm, Nucleus	FNab05114
MAP3K3^(L)	1:300	Cytoplasm	FNab09830
HDAC5^(M)	1:250	Cytoplasm, Nucleus	FNab03802
P2RX7^(N)	1:250	Cell membrane	FNab06071

人体心脏组织^（¹^），人体结肠癌组织^（²^），大鼠肝脏组织^（³^），人体乳腺癌组织^（⁴^）。一抗为阴性血清，多聚酶二抗Poly-HRP Goat anti rabbit IgG和Poly-HRP Goat anti mouse IgG按照1:50稀释。DAB染色10分钟，细胞核用苏木精复染。

阴性对照试验

人体心脏组织^（¹^），人体结肠癌组织^（²^），大鼠肝脏组织^（³^），人体乳腺癌组织^（⁴^）。一抗为阴性血清，多聚酶二抗Poly-HRP Goat anti rabbit IgG和Poly-HRP Goat anti mouse IgG按照1:50稀释。DAB染色10分钟，细胞核用苏木精复染。

总结

使用多聚酶二抗做 IHC 实验，获得了明显放大的信号，未出现非特异性结合，并且大大简化了实验程序。