IF实验常见问题及解决方案

免疫荧光实验（Immunofluorescence，IF）主要原理是利用荧光标记抗体作为探针对组织或细胞内特定抗原进行定位和定性分析。由于其特异性强、敏感度高、速度快等有点，广泛用于科学研究。这项技术并不复杂，但是在实验时会出现各种各样问题，从而得不到理想结果。下面列出IF实验常见问题及解决方案，希望对大家有帮助。

一.荧光信号弱

1.样本问题：

样本内抗原表达丰度低，建议适当提高一抗浓度，选择荧光更强的二抗；

样本保存不当导致抗原降解，建议选用新鲜制备的样本以及适当的保持条件。

2.固定方法不当：

甲醛固定会遮蔽抗原表位，导致信号减弱，需要选择合适的修复液进行抗原修复；

多聚甲醛会与GFP荧光蛋白发生醛化反应，导致信号减弱；

检测膜蛋白一般不建议使用甲醇或丙酮固定，有机溶剂能够破坏膜结构。

3.透化方法不对：

检查抗原表达位置，胞内蛋白需要做透化处理，细胞膜蛋白不需要。

4.一抗问题

一抗浓度低，建议提高一抗浓度；

一抗孵育不充分，建议4°孵育过夜；

一抗特异性不好，建议设置阳性对照确认抗体有效性或更换一抗。

5.二抗问题

二抗浓度低，建议提高二抗浓度并用阳性对照确认二抗有效性；

二抗孵育不充分，建议37°孵育1-2h；

二抗和一抗不配套，检查一抗和二抗属性。

6.光漂白

减少照明强度/时间。

选用抗荧光淬灭封片剂。

二.背景高

1.一抗问题

一抗浓度太高，需要降低一抗浓度。

一抗特异性不好，换特异性好的一抗。

2.二抗问题

二抗浓度太高，同一样本按照最佳一抗用量，使用不同浓度二抗，确定最佳二抗稀释比例。

做只加二抗的阴性对照，确认二抗本身的荧光背景。

3.封闭不完全

建议用二抗来源动物的非免疫血清进行封闭，延长封闭时间。

4.洗涤不充分

延长洗涤时间，充分洗涤。

三.细胞呈扁平状

1.细胞片被风干

使用湿盒，在任何时候不要让细胞片变干。

2.使用了甲醇固定

甲醇会破坏细胞膜，因此细胞不能保持好的形态，建议改用甲醛或戊二醛等其他固定试剂。

四.细胞有自发荧光

使用了戊二醛固定或材料本身（如石蜡）有自发荧光。

建议固定后染色前进行荧光淬灭，如使用NaIO4,
NaBH4,甘氨酸等，染色前检查自发荧光。

五.细胞模糊，封片剂明亮

洗涤不充分导致背景亮，建议充分洗涤

二抗结合太弱，确保抗体牢固结合。

六．整个细胞片都出现荧光亮点

二抗浓度过高，降低二抗浓度。

二抗发生沉淀，过滤或离心二抗。