FC实验步骤
一、细胞表面染色操作流程
1. 细胞计数：将培养好的细胞收集于15mL离心管并计数，若为贴壁细胞，需要先用胰酶消化细胞；300g离心5min，去上清。
2. 制备单细胞悬液：将收集的细胞用1mL 预冷0.5%BSA/PBS溶液重悬，300g离心5min，去上清，重复2次；用0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞至浓度1x107个细胞/mL，取100μl细胞悬液置于流式管内。
3. （可选）阻断Fc受体：可用抗体同源血清全IgG抗体与细胞充分混匀，室温孵育10-20min。
4. 一抗孵育：每管加入稀释后的一抗溶液100μl，2-8℃反应30min，孵育期间每隔10min晃动一下反应管，使细胞和抗体充分反应。若为直标抗体，需要避光反应，跳到步骤7。抗体稀释液为0.5%BSA/PBS溶液。
5. 洗涤：300g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。
6. 二抗孵育：对于非荧光染料直标抗体，加入100μl荧光二抗重悬，避光2-8℃反应30min，孵育期间每隔10min晃动一下反应管。
7. 洗涤：300g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。
8. 用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞，4℃保存，上机分析。
二、细胞胞内染色操作流程
1．细胞计数：将培养好的细胞收集于15mL离心管并计数，若为贴壁细胞，需要先用胰酶消化细胞；300g离心5min，去上清。
2．制备单细胞悬液：将收集的细胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重悬，300g离心5min，去上清，重复2次；用0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞至浓度1x107个细胞/mL，取100μl细胞悬液置于流式管内，300g离心5min去上清。
3．固定：每管加入100μl细胞固定剂重悬细胞，2-8°孵育20min。固定剂可用4% 甲醛。
4．洗涤：600g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。
5．通透：每管加入100μl细胞通透剂重悬细胞，室温孵育20min。通透剂可用0.5%BSA/PBS（0.3%TritonX-100）
6. 洗涤：600g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。
7. (可选）阻断Fc受体：用抗体同源血清全IgG抗体与细胞充分混匀，室温10-20min。
8. 一抗孵育：每管加入稀释后的一抗溶液100μl，2-8℃反应30min，孵育期间每隔10min晃动一下反应管，使细胞和抗体充分反应。若为直标抗体，需要避光反应，跳到步骤11。抗体稀释液为0.5%BSA/PBS溶液。
9. 洗涤：600g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。
10. 二抗孵育：对于非荧光染料直标抗体，加入100μl荧光二抗重悬，避光2-8℃反应30min，孵育期间每隔10min晃动一下反应管。对于直标抗体直接跳到步骤11。
11. 洗涤：600g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。
12. 用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞，4℃保存，上机分析。
注：实验建议设置空白对照，同型对照，空白对照不加一抗，同型对照将一抗替换为同型抗体