IHC实验操作流程

IHC实验步骤(石蜡切片)

一、石蜡包埋组织切片制备

1、将组织切成4mm厚，长宽各1cm左右大小，PBS洗涤1次，放入固定夹中，浸泡在4℃预冷的4%多聚甲醛固定液中，密闭，4℃固定过夜。

2、取出组织块，用4℃预冷PBS洗涤，浸泡在4℃的PBS中，3小时换液一次，彻底洗掉固定液。

3、按照如下步骤用乙醇将组织脱水：

4、按如下步骤将乙醇置换成二甲苯：

5、在55-60度烘箱中，将二甲苯置换成低温石蜡：

6、预先在70℃融化高温蜡（60-65℃），倒入模具，用镊子夹出浸蜡组织块放入模具，盖上60-65℃预热的固定夹板，倒入剩下蜡液浸没固定板30s，拿出模具，平放室温冷却1h，4℃冷却1h，取出蜡块。

7、在切片机上将4℃预冷的组织蜡块切成4-7um厚的薄片，移入42℃水浴中，小心用镊子将切片沿水面展平，再用低聚Lys预处理过的载玻片捞出组织切片，甩掉残留水滴，室温晾干。

8、石蜡切片染色前置 60℃烘箱中1h，融化掉组织周围石蜡，使组织紧贴载玻片。

注意：甲醛烟雾有毒，长期不用的固定液必须-20℃冻起来保存，4℃长期放置甲醛会氧化失去交联能力；组织块不能切太厚，会影响甲醛渗透；固定组织不可以过度，过度固定会严重影响后期实验，做不出阳性。

二、免疫组化实验操作

1、石蜡切片脱蜡水化：

(1)二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，各浸泡10min；

(2)乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，各浸泡5min；

(3)蒸馏水洗5min。

2、灭活内源性过氧化物酶：将切片浸入装有3%H2O2 的溶液中，盖上盖子，室温10min（避光）。内源性酶含量高的组织，可以延长灭活时间至15-20min。双氧水需新鲜配制，可提前5-10min配制。

3、蒸馏水洗：取出切片，用去离子水浸洗3次，每次1min。

4、抗原修复：根据待检测的抗原，选择EDTA或柠檬酸抗原修复液。

抗原微波修复：用塑料切片架，置于染片缸内，EDTA修复液淹没切片，选择高档（功率100%）5min，取出室温放置2min，再放回微波炉低档（功率10%）5min，取出染片缸，保持切片浸没在修复液中，室温自然冷却约30min。

抗原修复的注意事项：

(1)组织不能干。

(2)选择抗原修复方法要因抗体而异。

(3)抗原修复后至 DAB 显色的过程中，均需用 PBS 缓冲液。

5、取出切片，用PBS浸洗1min×3。

6、正常山羊血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态,），用组化笔沿着组织边缘画圈，滴加5%正常山羊血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃封闭30min。

7、滴加第一抗体：用滤纸吸去多余血清，不洗，直接滴加PBST稀释的一抗，4℃孵育过夜。

8、PBST浸洗10min×3。

9、甩干，滴加二抗工作液，37℃孵育60min。

10、PBST浸洗10min×3。

11、甩干，滴加适量DAB 工作溶液，镜下观察，通常1分钟左右可获得合适染色强度。之后迅速终止（去离子水冲洗干净终止）。DAB工作液现配现用。

12、滴加一滴Mayer苏木素复染1min，用去离子水冲洗干净，然后在PBS溶液中浸泡5-10min。

13、去离子水浸洗3次，每次1min。

14、脱水：将清洗后切片于无水乙醇中浸泡10秒，高温（55-60℃）下完全干燥。

15、封片：在切片中性滴加适量中性树胶封片。

16、成像：显微镜观察结果，图像采集和结果分析。

注意：染色过程中需一直保持切片处于湿润状态；染色过程中所有试剂使用过程中均需保证完全覆盖切片上组织。