IP实验操作流程

IP实验步骤

一、样本制备

1、 细胞收集

1.1、贴壁培养细胞收集：去除贴壁细胞的培养液，用预冷PBS清洗细胞2次，吸出PBS。

1.2、悬浮培养细胞收集：先3000转/min 离心5分钟收集细胞沉淀，再用预冷PBS轻轻吹打重悬，离心收集细胞沉淀。

1.3、组织样本收集：用干净的医用剪剪碎目标组织，使组织块尽量小，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止样品被蛋白酶降解。将组织用液氮或超低温冰箱中冷冻30min，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。

2、总蛋白提取

2.1、细胞/组织裂解：对于细胞样本，加入预冷的RIPA裂解缓冲液(含有PMSF)（每107细胞/100 mm 培养皿/150cm2 培养瓶加入1ml；每5×106细胞/60mm 培养皿/75cm²培养瓶加 0.5ml），冰上裂解15min。

2.2、对于组织样本，按照1mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液，多次匀浆，直至组织完全匀浆，收集匀浆液。（裂解液中根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂）。

2.3、离心：把裂解好的样本置于于预冷的高速冷冻离心机中，12000rpm，10min。

2.4、浓度测定：离心完成后，弃去沉淀，保存上清。吸取10μl蛋白上清做蛋白浓度测定。

建议：

(1)高浓度的去垢剂会干扰免疫沉淀效果。所以可先用小体积RIPA裂解细胞制备裂解物，在开始IP捕获前，再补加1 X PBS或孵育液稀释到需要的体积。

(2)使用足量的蛋白裂解物：单管IP实验，推荐裂解物初始体积为0.2–0.4ml, 含1–3 mg总蛋白。可采用Bradford 或BCA法测定总蛋白浓度。

(3)裂解液中加蛋白酶抑制剂，用量可以是正常WB实验制样的1.5-2倍。

3、裂解物预处理（可选）

3.1、45°角剪掉枪头末端，快速吸取重悬的Protein A sepharose beads悬液，加入含有裂解物的EP管中。通常1-3mg总蛋白裂解物需加入30μl重悬的Protein A sepharose beads悬液。

3.2、4℃旋转孵育60min（推荐用垂直旋转混合仪，低速旋转）。

3.3、4℃、500g 离心1min，将上清转入新的EP管中。

建议：对于富含IgG的组织，推荐裂解物预处理步骤。

二、免疫沉淀

1、吸取含有1-3mg总蛋白的裂解液（或预处理）0.2-0.4mL 加入EP管中，然后加入约4μg目标抗体。另取等量裂解物，加入等量同型IgG和等量孵育液孵育作为control IgG对照组。4℃旋转孵育2-4h或过夜。

2、然后加入50μl重悬的Protein A sepharose beads，4℃旋转孵育2-4h。

3、4℃、500g 离心30s，弃上清。

4、每次用1mL 1xTBST(现加蛋白酶抑制剂)洗涤沉淀复合物，4℃、500g 离心30s，弃上清。重复洗涤4次，最后一次离心结束后，EP管中保留80μl液体，其他弃去。

5、加入20μl 5x SDS Sample Buffer，重悬复合物，95℃加热变性5min。8000-10000g 离心3min, 小心吸取上清转入新的EP管中。

三、WB分析

1、将收集的IP样本进行SDS-PAGE电泳，剩下的IP样本保存在-80℃。

2、电泳后转膜，使用合适抗体进行后续分析。

四、二抗选择

注：孵育液配方