- 货号
FNCK022
- 中文名称
Calcein AM/PI活死细胞双染试剂盒
- 规格
100T/500T
- 试剂盒组件
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试剂
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100T
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500T
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保存条件
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Calcein AM Solution (100 μM)
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100 μL
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500 μL
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-20°C，避光
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PI Solution (750 μM)
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100 μL
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500 μL
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-20°C，避光
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Calcein AM Assay Buffer
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25 mL
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55 mL× 2
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-20°C
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说明书
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1 份
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- 保存条件
-20°C避光可保存1年。Calcein AM Solution (100 μM)首次使用时建议适当分装并密封避光保存，防止潮湿环境中发生自发性酯水解。
- 检测原理
Calcein AM/PI Live/Dead Double Staining Kit可用于区分含有酯酶活性的哺乳动物的死细胞和活细胞，Calcein AM是在传统的Calcein上添加上乙酰甲氧基甲酯即（AM）基团，疏水性增加，能很容易穿透活细胞膜，进入细胞内。Calcein AM本身无荧光，进入细胞后被细胞中内源性酯酶水解，生成具有强负电荷且不能通过细胞膜的极性分子Calcein滞留在细胞内，而Calcein可发出强绿色荧光（Ex/Em= 494nm/517nm）。由于死细胞缺乏酯酶，不能或很少能产生Calcein，因此仅活细胞会被染色为强绿色荧光，死细胞不能被染色或者染色非常弱。死细胞的细胞膜选择透过性丧失，碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）可以进入胞内与双链DNA特异性结合并产生强烈的红色荧光（Ex/Em=535nm/617nm），从而对死细胞进行标记。因此，Calcein AM与碘化丙啶联合使用，可以对活细胞与死细胞同时进行双重荧光染色，可用于细胞活性与细胞毒性的检测。
- 自备试剂
PBS缓冲液（pH7.2~7.4）
- 检测步骤 (仅供参考)
1. 流式细胞仪检测
1.1 工作液的配制
1.1.1 试剂准备：取出冻存的Calcein AM/PI Double Staining Kit，室温解冻后，涡旋混匀各试剂。
1.1.2 配制Calcein AM/PI染色工作液：室温解冻后，将涡旋混匀的Calcein AM Solution和PI Solution 按照1~5×105 个细胞/200 μL配制染色工作液。根据实验用量参考下表配制染色工作液。
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组分
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Calcein AM/PI染色工作液体积
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1 mL
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5 mL
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10 mL
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Calcein AM Solution (100 μM)
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0.1 μL
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0.5 μL
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1 μL
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PI Solution (750 μM)
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1 μL
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5 μL
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10 μL
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Calcein AM Assay Buffer
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1 mL
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5 mL
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10 mL
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注：染色工作液中的 Calcein AM 易潮解，建议现配现用。
提示：为节约试剂及保证实验的准确性，可先将Calcein AM Solution进行梯度稀释，如用Calcein AM Assay Buffer将Calcein AM Solution(100 µM)稀释100倍到1 µM。染色前再使用Calcein AM Assay Buffer将1 µM的Calcein AM Solution稀释100倍到染色浓度（0.01 µM)，即200 μL Calcein AM Assay Buffer中加入2 μL 1 µM的Calcein AM Solution。
1.1.3 用于阴性对照与补偿调节的单染管工作液配制参考下表配制：
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组分
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Calcein AM单染工作液（1 mL）
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PI单染工作液（1 mL）
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阴性对照（1 mL）
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Calcein AM Solution (100 μM)
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0.1 μL
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0 μL
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0 μL
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PI Solution (750 μM)
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0 μL
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1 μL
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0 μL
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Calcein AM Assay Buffer
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1 mL
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1 mL
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1 mL
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注：染色工作液中的Calcein AM易潮解，建议现配现用；阴性对照管与单染管的细胞选择阳性药物组细胞。
1.2 染色流程
1.2.1 收集细胞，300×g离心5 min，去上清，加入1 mL PBS重悬细胞沉淀，300×g离心5 min，去上清，重复洗涤1次，去上清。
1.2.2 每组1~5×105个细胞加入200 μL染色工作液重悬，室温避光孵育5~15 min。
1.2.3 孵育完成后，可以直接进行流式细胞仪检测，若不能及时检测，建议避光置于4°C冰箱，2 小时内进行流式细胞仪检测。
注：流式细胞仪检测时，Calcein可用FITC通道，PI可用Percp/Cy5.5通道或PE通道。
2. 荧光显微镜检测
2.1 工作液的配制
2.1.1 试剂准备：取出冻存的Calcein AM/PI Double Staining Kit，室温解冻后，涡旋混匀各试剂。
2.1.2 配制Calcein AM/PI染色工作液：室温解冻后，将涡旋混匀的Calcein AM Solution和PI Solution
按照96孔板每孔100 μL或24孔板每孔200 μL配制染色工作液。根据实验用量参考下表配制染色工作液。
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组分
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Calcein AM/PI染色工作液体积
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1 mL
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5 mL
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10 mL
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Calcein AM Solution (100 μM)
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10 μL
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50 μL
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100 μL
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PI Solution (750 μM)
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10 μL
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50 μL
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100 μL
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Calcein AM Assay Buffer
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1 mL
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5 mL
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10 mL
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注：染色工作液中的Calcein AM易潮解，建议现配现用。
Calcein AM Assay Buffer有利于荧光探针的装载和荧光信号的维持，若贴壁细胞易脱落且敏感，建议使用基础培养基配制上述染色工作液。
2.2 染色流程
2.2.1 小心吸除贴壁细胞的培养基，每孔加入适量PBS洗涤细胞，去除PBS，重复洗涤1次，吸除PBS。
2.2.2 按照96孔板每孔100 μL或24孔板每孔200 μL的比例加入染色工作液，37°C孵育10~30 min。（基础培养基配制染色工作液需延长染色时间至30~60min，在反应结束前10 min加入PI Solution。）
2.2.3 孵育结束后，在荧光显微镜下观察染色效果（Calcein为绿色荧光，Ex/Em=494nm/517nm；PI为红色荧光，Ex/Em=535nm/617nm）。
注：若是悬浮细胞，则收集细胞沉淀后，按照1~5×105个细胞加入200 μL染色工作液重悬，室温避光孵育15~20 min，吸取细胞悬液滴加在载玻片上，轻轻盖上盖玻片即可在显微镜下观察拍照。
- 注意事项
1. 本产品仅限于专业人员的科学研究使用。
2. 请注意安全事项，遵守实验室试剂操作规范操作。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
3. 请按照合适的温度保存本产品，以免失效。
4. 染色前使用无血清培养基（血清中可能含有酯酶）或者PBS洗涤细胞，缓冲液中不能含有初级或次级胺，因为脂肪组胺可裂解AM酯并妨碍负载。
5. 染色温度为37°C可以降低染色所需时间。室温下染色可减轻荧光探针渗入细胞器的副作用。
6. Mn2+会加速荧光淬灭，洗涤buffer中注意不要含有Mn2+等金属离子。
7. 渗漏：AM酯可被P糖蛋白多药载体排除。
8. 适用于任何含酯酶活性的动物细胞，植物和细菌因含有细胞壁，Calcein AM不能进入细胞内，因此不适用于植物和细菌样本。
9. 可用5%~20%的DMSO处理细胞2-4h，或70%的酒精处理细胞30分钟来获得阳性质控样本。
10. 离心机升速和降速过高会引起细胞的损失，建议调整升速不大于3，降速不大于2，即Acc≦3，Dec≦2。
11. 用于荧光显微镜检测时，对于贴壁能力弱的细胞，建议先做防脱处理后再进行细胞接种和染色，且 PI染色时间不要超过30min，否则会导致PI假阳性，若需要延长Calcein AM染色时间，可在染色结束前的10~30min内加入PI，染色后1-2h内及时拍照。
