TUNEL In Situ Apoptosis Kit (HRP-DAB Method)

FNCK105

TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒（HRP-DAB显色法）

20 Assays / 50 Assays / 100 Assays

-20℃可保存一年。Streptavidin-HRP和DAB Concentrate (20×)需避光保存。

TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒（HRP-DAB显色法）是一种高灵敏度且操作简便的细胞凋亡检测方法。本试剂盒适用于组织样本(石蜡切片、冰冻切片)和细胞样本(细胞涂片、细胞爬片)的原位凋亡检测，检测结果可通过普通光学显微镜观察。

细胞在发生凋亡时，会激活一些特异性的DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA，暴露的3’-OH可在末端脱氧核酸转移酶(TdT)的催化下与生物素标记的dUTP连接，辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)可与生物素结合，在HRP的催化下通过DAB显色来观测凋亡细胞，结果可通过普通光学显微镜进行观察。

1. 细胞样本

固定液（4%多聚甲醛溶于PBS）。

阻断剂（3% H2O2溶于去离子水）。

通透液（0.2%的Triton-100溶于PBS）。该溶液建议提前1天配制在4度保存。

2.石蜡切片

二甲苯、无水乙醇。

阻断剂（3% H2O2溶于去离子水）。

3.冰冻切片

固定液（4%多聚甲醛溶于PBS）。

阻断剂（3% H2O2溶于去离子水）。

4.其他试剂

PBS、ddH2O、苏木素、中性树胶。

5.仪器

光学显微镜。

1)1×蛋白酶 K 工作液：取 1 μL Proteinase K (100×) 加入99 μL PBS 中，混匀。现用现配。

2)1×DNase I Buffer 工作液：按照 9:1 的比例用 ddH2O 将DNase I Buffer (10×) 稀释待用。现配现用。

3)DNase I 工作液（200 U/mL）：用 1×DNase I Buffer 工作液，按照 99：1 稀释比将 DNase I (20 U/μL) 稀释待用。现配现用。

注： DNase I 会在剧烈混合下变性，建议不要涡旋DNase I 溶液。

4）1×DAB工作液

按照19:1的比例用DAB Dilution Buffer将DAB Concentrate (20×) 稀释待用。现用现配。

样本处理

1.细胞样本

1)细胞爬片：将细胞爬片浸入PBS漂洗1次，滤纸吸干周围水分，再浸入固定液（自备），室温固定15~20 min 或4°C固定1~2 h。

细胞涂片：收集细胞，加入一定体积的 PBS 重悬细胞沉淀，然后加入和PBS等体积的固定液（自备），室温固定15~20 min 或 4 °C 固定 1~2 h。600×g 离心5 min，PBS重悬，取 25~50 μL细胞悬液涂片在载玻片上晾干。

2)固定好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

3)将样本浸入阻断剂（自备）中，室温封闭10 min。

4)封闭好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

5)将样本浸入通透液（自备）中，37 °C作用10 min。

6)将通透好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

2.石蜡切片

1） 用常规方法将切片脱蜡水化。将切片浸入二甲苯（自备）脱蜡2次，每次10 min；无水乙醇（自备）浸泡切片2次，每次5 min；90%、80%、70%的乙醇水溶液（自备）各一次，每次3 min。

注：低温可能影响二甲苯脱蜡效果。当室温低于20°C时，二甲苯脱蜡时间可延长至20 min。

2）脱蜡好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

3）吸干切片组织周围的水分，每个样本上滴加100 μL 1×Proteinase K工作液，37°C反应20 min。

注：不同组织或物种的样本反应时间可能不同，建议进行预实验，确定反应时间。

4）将通透好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

5）吸干切片周围的水分，样本浸入阻断剂（自备）中，室温（15~25°C）封闭10 min。

6）样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

3.冰冻切片

1) 取出冰冻切片，平衡至室温，再浸入固定液（自备），室温（15~25°C）固定30 min。

2) 固定好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

3) 每个样本上滴加100 μL 1× Proteinase K工作液，37°C反应10~20 min。

注：不同组织或物种的样本反应时间可能不同，建议进行预实验，确定反应时间。

4) 将通透好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

5) 吸干切片周围的水分后，样本浸入阻断剂（自备）中，室温（15~25°C）封闭10 min。

6) 样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

1.分组设置

阳性对照

1)滴加 100 μL 1×DNase I Buffer 工作液到已通透的样本上，室温平衡 5 min。

2)用吸水纸去除样本上多余的液体。加入100 μL 稀释后的DNase I 工作液（200 U/mL)，37°C 孵育 10~30 min。

3)样本浸入PBS漂洗 3次，每次5 min。

阴性对照

1)滴加 100 μL 1×DNase I Buffer 工作液到已通透的样本上,室温平衡5 min。

2)DNase I Buffer 孵育阴性样本，37°C 孵育 10~30 min。

3)样本浸入PBS漂洗 3次，每次5 min。

实验组

1）实验组通透完成后在 PBS中静置，等待阳性对照和阴性对照处理后共同进行标记染色。

2.工作液的配制

1)TdT酶工作液配制

参考下表配制适当TdT酶工作液，充分混匀，现用现配。

注：

1.TdT Equilibration Buffer使用前，室温静置直至完全溶解。冰冻的平衡液融化后可能会出现钴盐结晶，此为正常现象，可在使用前涡旋混匀。

2.TdT Enzyme对温度较敏感，请严格保存于-20°C，使用前取出，使用后立即放回。

3.配制TdT酶工作液时，建议不要涡旋。

4.通过在组织切片上倒扣盖玻片的方式（注意防止搓动组织导致样本结构损伤）。

2)Streptavidin-HRP工作液配制

参考下表配制适量的Streptavidin-HRP工作液，充分混匀，现用现配。

3.标记和显色步骤

1）每个样本滴加100 μL TdT Equilibration Buffer ，37°C湿盒中平衡10~30 min。

2）吸水纸吸除TdT Equilibration Buffer（注意不要干片）。每个样本滴加50 μL TdT酶工作液，放入湿盒中37°C避光反应60 min。

3）样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

4）吸水纸吸干水分后滴加100 μL Streptavidin-HRP工作液，放入湿盒中37°C避光反应30 min。

5）样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

注：可适当延长洗涤时间或洗涤次数，否则残留的HRP会增加染色背景。

6）吸水纸吸干样本周围的水分，滴加100 μL的1×DAB工作液，室温孵育30 s~5 min 或根据显色情况孵育适当时间。

注：如果显色强，可在显微镜下观察到棕色即停止显色；如显色弱，可适当延长显色时间。

7）显色完成后样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

8）（选做）：苏木素染色液进行细胞核染色，随后用PBS漂洗3次，每次5 min。

9）将切片置于水中冲洗后，将切片依次放入：70%酒精-80%酒精-90%酒精-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ中脱水透明，每个试剂中放置2 min，最后在通风橱中风干切片。

10)将中性树胶（自备）滴在组织旁边，并用盖玻片封片，注意避免产生气泡，封好的切片水平置于通风橱中晾干。

11)光学显微镜下观察、拍照。

1.洗涤过程应充分洗涤，否则会影响后续实验中酶的活性（如DNase I和TdT酶）。用PBS清洗样本后，请用吸水纸吸干样本周围的液体。

2. 实验过程中请保持样本的湿润，防止干片造成的实验失败。

3. TdT酶避免反复冻融，建议不要涡旋。

4.本说明书中推荐的条件是通用的，用户可根据不同的样本类型和预实验的结果，对样本处理时间、试剂浓度等条件进行优化，选择最合适的实验条件。

5.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。