- 货号
K092
- 中文名称
SYBR Green qPCR Mix (含示踪染料)
- 规格
100T/500T
- 试剂盒组份
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Item
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100T
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500T
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SYBR Green qPCR Mix (2X, Blue)
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1 mL
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1 mL*5
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Template Dilution Buffer (40X, Yellow)
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0.2 mL
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1 mL
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Low ROX (50X)
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40 μL
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0.2 mL
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High ROX (50X)
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40 μL
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0.2 mL
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- 保存条件
-20℃避光保存，一年有效； 4℃避光保存，一个月内有效。尽量避免反复冻融。
- 产品简介
SYBR Green qPCR Mix with Tracking Dyes是一种用于实时荧光定量PCR，即qPCR(Quantitative PCR)或real-time PCR，含双染料示踪系统(with a dual-dye tracking system)高品质预混液，可利用两种示踪染料混合后产生的变色效应追踪移液过程，方便用户分辨空白孔和加入qPCR Mix的孔，并确认体积较少的DNA样品是否已经添加到qPCR Mix中，可快速便捷的用于cDNA或基因组DNA等的特异性超高灵敏度定量。
在进行qPCR反应体系的溶液配制时，由于DNA样品加入的体积通常只有1-2微升左右，很难通过肉眼分辨是否已经加入了样品。本产品中的SYBR Green qPCR Mix (2X, Blue)中添加有示踪作用的惰性蓝色染料，同时提供具有惰性黄色染料的模板稀释液Template Dilution Buffer (40X, Yellow)，在配制qPCR反应体系时，随着两个组分的混合，溶液颜色会产生显著变化，即当黄色溶液加入到蓝色溶液中后，变成绿色溶液，从而可以根据液体颜色变化准确判断是否已加入DNA模板和qPCR mix，这就在加样过程中起到示踪作用，提高qPCR体系设置的正确率，避免漏加或错加模板等。
SYBR Green qPCR Mix (2X, Blue)使用SYBR Green I作为染料。SYBR Green I是一种结合于双链DNA双螺旋小沟区域的绿色荧光染料。SYBR Green I在游离状态下的荧光比较微弱，一旦与双链DNA结合后，其荧光会大大增强。这样通过检测荧光强弱就可以定量检测PCR过程中扩增产生的双链DNA的数量。
本产品使用的Taq DNA Polymerase是一种与抗体结合的高品质热启动酶，能够实现便捷高效的热启动。Taq DNA Polymerase中的Taq酶与抗Taq酶的单克隆抗体相互结合，从而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性，这样可以有效避免在低温条件下由引物和模板DNA非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。在PCR反应的预变性步骤中抗体会被加热失活，这样可以确保仅在预变性后才会把Taq酶的活性释放出来，预变性之前不会发生DNA聚合反应，从而大大提高了PCR反应的特异性、灵敏度和定量检测的准确性。
本产品包含了Taq DNA Polymerase、示踪染料、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green I荧光染料、稳定剂和镁离子等所有的通用组分，使操作更简单、使用更便捷。用户只需自备引物、样品DNA和去离子水即可。
本产品提供了Low ROX和High ROX，广泛兼容于无需ROX和需要Low ROX或High ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪。ROX的作用是用于校正与PCR无关的荧光波动，从而最大限度减少孔间差异。这种差异可能由多种因素引起，如移液误差及样品蒸发等。不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同，请根据实际所用仪器在配制反应体系时选择高浓度ROX (High ROX)、低浓度ROX (Low ROX)或不加ROX。
- 实验步骤
一、设置PCR反应体系：
1.融解并混匀PCR反应所需各种溶液。将所有试剂完全溶解并混匀后置于冰浴上或冰盒内。
2.模板稀释（可选）：如不需要进行模板的示踪，则可以不使用Template Dilution Buffer进行模板稀释即可。
本产品提供的Template Dilution Buffer (40X, Yellow)为40X，在最终的PCR反应体系中须为1X。
以原始模板DNA (Original Template DNA)稀释至100µl (Total Template DNA)为例，根据“稀释后的模板(Diluted Template DNA)加入到20µl qPCR反应体系中的体积”，对应的原始模板的稀释方法可参考下表(对于20µl qPCR反应体系，通常稀释后的模板加入量为2µl或4µl，不能超过8µl)：
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Volume for Diluted Template DNA in 20µl qPCR Reaction System (µl)
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1
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2
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3
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4
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5
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6
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7
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8
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Template Dilution Buffer (40X, Yellow) (µl)
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50
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25
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16.7
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12.5
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10
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8.4
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7.2
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6.3
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Original Template DNA (µl)
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x
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x
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x
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x
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x
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x
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x
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x
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Ultrapure Water (µl)
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50-x
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25-x
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16.7-x
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12.5-x
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10-x
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8.4-x
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7.2-x
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6.3-x
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Final volume (µl)
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100
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100
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100
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100
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100
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100
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100
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100
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3.参考下表在室温或冰浴上设置PCR反应体系（以96孔板为例）：
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Reagent
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Volume (μl)
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SYBR Green qPCR Mix(2X, Blue)
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10
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Template DNA
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x
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引物混合物（2.5μM each）
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2
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Without or Low/High ROX (50X)
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0.4
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Ultrapure Water
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To 20μL
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注1：通常引物的终浓度为0.2-0.5μM时可获得良好的检测效果，也可根据情况在0.1-1.0μM范围内调整引物的终浓度。
注2：通常DNA模板的量以1-10ng cDNA或10-100ng基因组DNA为参考用量。因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数同，如有必要，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。RT-PCR反应得到的cDNA直接作为模板时，其添加量不要超过PCR反应总体积的10%。
4. 用移液器轻轻吹打混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
5.按把设置好的PCR反应体系置于PCR仪上，开始PCR反应。
二、PCR反应程序：
在Real-time PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃ 2分钟，复杂或高GC模板适当延长时间至5分钟。本产品中的Taq DNA Polymerase可以在15秒内可完成至少300bp的扩增，可以满足绝大多数的qPCR实验；对于超过350bp或者高GC含量的扩增子，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。建议采用如下的PCR程序，本程序是以ABI 7900HT荧光定量PCR仪为例：
预变性: 95℃ 2min
变性: 95℃ 15sec
退火/延伸: 60℃ 15-30sec
循环: 重复变性和退火/延伸，共40个循环
熔解曲线分析(可选)：95℃ 15sec, 60℃ 15sec, 95℃ 15sec
使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果
注：三步法只需要在退火/延伸后加上一步72℃ 30sec。
- 注意事项
1.注意引物退火温度，当退火温度<60℃时，推荐使用三步法PCR扩增。
2.本产品中含有SYBR Green I荧光染料，保存本产品或设置PCR反应时应避免强光照射，以尽量避免荧光淬灭问题。
3.对于超过350bp或者高GC含量的扩增片段，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。
4.qPCR检测是超高灵敏度的检测，PCR反应设置区域需尽量避免各种可能的待扩增产物的污染。PCR产物宜密封后丢弃，以避免超高浓度的PCR产物污染实验环境。
5.尽管本产品经过10次反复冻融后仍具有和冻融前几乎相同的PCR扩增效果，但仍宜适当避免反复冻融本产品，多次反复冻融可能使产品性能下降。
6.本产品仅限科研人员使用，不能用于临床诊断或治疗，食品或药品，不得存放于普通住宅。
7.为了您的安全和健康，请穿好衣服，戴好一次性手套。
