SYBR Green qPCR Mix(2X)

K093

1mL/1ml*5

-20℃避光保存，一年有效； 4℃避光保存，一个月内有效。尽量避免反复冻融。

SYBR Green qPCR Mix (2X)是一种用于实时荧光定量PCR，即qPCR(Quantitative PCR)或real-time PCR的高品质预混液，主要用于cDNA和基因组DNA等的特异性超高灵敏度定量检测。

SYBR Green qPCR Mix (2X)使用SYBR Green I作为染料。SYBR Green I是一种结合于双链DNA双螺旋小沟区域的绿色荧光染料。SYBR Green I在游离状态下的荧光比较微弱，一旦与双链DNA结合后，其荧光会大大增强。这样通过检测荧光强弱就可以定量检测PCR过程中扩增产生的双链DNA的数量。

本产品使用的Taq DNA Polymerase是一种与抗体结合的高品质热启动酶，能够实现便捷高效的热启动。Taq DNA Polymerase中的Taq酶与抗Taq酶的单克隆抗体相互结合，从而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性，这样可以有效避免在低温条件下由引物和模板DNA非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。在PCR反应的预变性步骤中抗体会被加热失活，这样可以确保仅在预变性后才会把Taq酶的活性释放出来，预变性之前不会发生DNA聚合反应，从而大大提高了PCR反应的特异性、灵敏度和定量检测的准确性。

本产品包含了Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green I荧光染料、稳定剂和镁离子等所有的通用组分，使操作更简单、使用更便捷。用户只需自备引物、样品DNA和去离子水即可。

本产品不含ROX，适用于无需ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪。

1mL如果用于常规的96孔板qPCR检测(建议反应体系为20μl)，每毫升本产品可以进行100次检测；如果用于常规的384孔板qPCR检测(建议反应体系为10μl)，每毫升本产品可以进行200次检测。

一、设置PCR反应体系：

1.融解并混匀PCR反应所需各种溶液。将SYBR Green qPCR Mix(2X)置于冰浴上或冰盒内。

2.参考下表在冰浴条件设置PCR反应体系（96孔板为例）。

注意：通常引物的终浓度为0.2-0.5μM时可获得良好的检测效果，也可根据情况在0.1-1.0μM范围内调整引物的终浓度。通常DNA模板的量以1-10ng cDNA或10-100ng基因组DNA为参考用量。因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，如有必要，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。RT-PCR反应得到的cDNA直接作为模板时，其添加量不要超过PCR反应总体积的10%。

3. 用移液器轻轻吹打混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。

4.按把设置好的PCR反应体系置于PCR仪上，开始PCR反应。

二、PCR反应程序：

在Real-time PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃ 2分钟，复杂或高GC模板适当延长时间至5分钟。本产品中的Taq DNA Polymerase可以在15秒内可完成至少300bp的扩增，可以满足绝大多数的qPCR实验；对于超过350bp或者高GC含量的扩增子，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。建议采用如下的PCR程序，本程序是以ABI 7900HT荧光定量PCR仪为例：

预变性: 95℃ 2min

变性: 95℃ 15sec

退火/延伸: 60℃ 15-30sec

循环: 重复变性和退火/延伸，共40个循环

熔解曲线分析(可选)：95℃ 15sec, 60℃ 15sec, 95℃ 15sec

使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果

注：三步法只需要在退火/延伸后加上一步72℃ 30sec。

1.注意引物退火温度，当退火温度<60℃时，推荐使用三步法PCR扩增。

2.本产品中含有SYBR Green I荧光染料，保存本产品或设置PCR反应时应避免强光照射，以尽量避免荧光淬灭问题。

3.对于超过350bp或者高GC含量的扩增片段，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。

4.qPCR检测是超高灵敏度的检测，PCR反应设置区域需尽量避免各种可能的待扩增产物的污染。PCR产物宜密封后丢弃，以避免超高浓度的PCR产物污染实验环境。

5.尽管本产品经过10次反复冻融后仍具有和冻融前几乎相同的PCR扩增效果，但仍宜适当避免反复冻融本产品，多次反复冻融可能使产品性能下降。

6.本产品仅限科研人员使用，不能用于临床诊断或治疗，食品或药品，不得存放于普通住宅。

7.为了您的安全和健康，请穿好衣服，戴好一次性手套。