Catalase (CAT) Activity Assay Kit

K094

过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒

100T

-20℃可保存一年。过氧化氢酶检测缓冲液和过氧化氢酶反应终止液也可以2-8℃保存。

过氧化氢酶活性检测试剂盒(Catalase Activity Assay Kit)是一种简单易行的通过显色反应来检测细胞、组织或其它样品中过氧化氢酶 (Catalase)活性的试剂盒。在过氧化氢相对比较充足的情况下，过氧化氢酶可以催化过氧化氢产生水和氧气。残余的过氧化氢在过氧化物酶 (Peroxidase) 的催化下可以氧化生色底物，产生红色的产物 (N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonate-p benzoquinonemonoimine)，最大吸收波长为520nm。用过氧化氢标准品，制作标准曲线，这样就可以计算出样品中的过氧化氢酶在单位时间单位体积内催化了多少量的过氧化氢转变为水和氧气，从而可以计算出样品中过氧化氢酶的酶活力。

1.试剂盒准备:

a.制备250mM过氧化氢溶液。本试剂盒提供的过氧化氢浓度约为1M。由于过氧化氢不是很稳定，使用前应自行确定过氧化氢的实际浓度。用本试剂盒提供的过氧化氢酶检测缓冲液将浓度约1M的过氧化氢稀释100倍，使过氧化氢浓度约为10mM。测定A240。测定时需要设置等体积的双蒸水作为空白对照，并在计算中减去该空白对照。

浓度计算公式:c=A/(ε×b)。c为样品浓度(mol/L或M); A为吸光度值; ε为波长相关的摩尔消光系数(L×mol-1×cm-1或M-1×cm-1)，过氧化氢的摩尔消光系数为43.6M-1cm-1。B =光程(cm)。

因此，过氧化氢的浓度(mM)=22.94×A240/b

示例：将本试剂盒提供的约为1M的过氧化氢用双蒸水稀释100倍后，用96孔酶标仪及一般的96孔板进行检测，每孔200 µl，每组3个平行。双蒸水对照组的平均A240为3.750，过氧化氢样品组的平均A240为3.974，差值为0.224，200 µl样品的光程为0.552cm。代入公式，过氧化氢浓度(mM)=22.94×0.224/0.552=9.31，则实际本试剂盒提供的过氧化氢浓度为0.931M。然后再根据实际的过氧化氢浓度配制250mM过氧化氢溶液。

b. 配制5mM过氧化氢溶液。根据测定得到的实际过氧化氢浓度配制5mM过氧化氢溶液。

c. 配制显色工作液。在冰浴上溶解显色底物，适当分装后再使用，尽量避免反复冻融。其它试剂放置在冰浴上备用。取适 当量的过氧化物酶，按照1:1000的比例用显色底物稀释，配制成显色工作液。例如取5µl过氧化物酶，加入5ml显色底物，混匀即得到5ml显色工作液。

2.样品的制备:

用适当裂解液裂解细胞或组织。用该试剂盒提供的过氧化氢酶检测缓冲液对样品进行稀释。裂解好的样品至少加入等体积的过氧化氢酶检测缓冲液进行稀释。

3.标准曲线的测定:

分别取0、12.5、25、50、75µl配制好的5mM过氧化氢溶液至1.5ml或0.5ml塑料离心管中，分别加入过氧化氢酶检测缓冲液至终体积为100µl，混匀。此时过氧化氢溶液浓度分别为0、0.625、1.25、2.5、3.75mM。必要时可设定更高浓度的过氧化氢标准溶液。

各取4 µl，分别加入到96孔板中。 加入200 µl的显色工作液。在25℃孵育至少15 min后测定A520，但孵育时间不应超过45 min(该步骤可与样品测定步骤中的最后一步同时进行)

4.样品测定:

a. 参照上表，取x µl(0 ~ 40 µl)样品放入1.5 ml塑料离心管中。加入过氧化氢酶检测缓冲液至体积为40 µl (即加入40-xµl过氧化氢酶检测缓冲液)，混匀。另外加入10 µl 250 mM过氧化氢溶液，使用移液器快速混匀。在25℃下反应1-5min。

b. 加入450 µl过氧化氢酶反应终止液，倒置或涡旋混匀以终止反应。在反应终止后15min内完成下面的c和d两个步骤。.

c. 在清洁的塑料离心管中加入40 µl过氧化氢酶检测缓冲液，再加入10 µl已终止混匀的上述反应体系，混匀。

d. 从上一步50 µl体系中取10 µl添加到96孔板中的一个孔中。加入200 µl显色工作液。

e. 在25℃孵育至少15 min后测定A520，但孵育时间不应超过45 min。

5. 样品中过氧化氢酶活性的计算:

a. 计算标准曲线。A520 = k[过氧化氢微摩尔数]+b，通过标准曲线计算出k和b值。

b. 计算样品中残留过氧化氢的微摩尔数。残留过氧化氢的微摩尔= (A520-b)/k

c. 过氧化氢酶酶活性单位定义:一个酶活性单位（1 unit）在25℃、pH 7.0的条件下，可在1分钟内催化分解1微摩尔过氧化氢。

d1 细胞或组织样本中过氧化氢酶活性的计算:

[样品过氧化氢酶酶活力]＝[消耗过氧化氢微摩尔数] x [稀释倍数]/([反应分钟数] x [样品体积] x [蛋白浓度])

[样品过氧化氢酶酶活力]的单位为units/mg蛋白

[消耗过氧化氢微摩尔数]＝[空白对照残余过氧化氢微摩尔数]－[样品残余过氧化氢微摩尔数]

[稀释倍数]＝250

[反应分钟数]即为实际的反应分钟数

[样品体积]为表中的X µl，以毫升来表示即为X/1000ml。

[蛋白浓度]为取X µl样品时，样品中的蛋白浓度，单位为mg/ml。

d2 血浆等液体样品的过氧化氢酶活力计算:

[样品过氧化氢酶酶活力]＝[消耗过氧化氢微摩尔数] x [稀释倍数]/([反应分钟数] x [样品体积])

[样品过氧化氢酶酶活力]的单位为units/ml样品

1.待测过氧化氢酶样品，无论是纯过氧化氢酶还是细胞或组织裂解产物，通常在4℃可以保存1周，在-70℃长期保存，但在-20℃保存后过氧化氢酶活性会明显下降。

2.检测过程中加入过氧化氢酶反应终止液后15分钟内需开始显色反应。

3.过氧化氢不是很稳定，准确的过氧化氢浓度应按说明书中的方法确定。

4.如需对样品中的过氧化氢酶活力进行精确定量，需要使用蛋白浓度测定试剂盒。

5.本产品仅限于专业科研人员使用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放在普通住宅内。

6.为了您的安全与健康，请穿上实验服，戴上一次性手套操作。