ELISA疑难解答提示
若实验结果不理想，请及时将显色结果拍照并保存实验数据，保留所用板条及未使用试剂。凭试剂盒盒面货号及批次号，联系我公司技术支持为您解决问题。同时您也可以参考以下表格自查原因：
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问题描述 |
可能原因 |
相应对策 |
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标准曲线无信号 |
检测试剂加样顺序不对 |
确认各步骤所加试剂正确，可重做一次并确认 |
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混淆了不同试剂盒的组件 |
使用试剂盒本身的各组件，可重做一次并确认 |
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漏加试剂 |
确认试剂是否添加 |
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标准曲线显色过强 |
混淆了不同试剂盒的组件，或配置工作液浓度过高 |
使用试剂盒本身的各组件，可重做一次并确认 |
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标准曲线图形不好 |
曲线选择不恰当 |
尝试使用不同方法绘制曲线 |
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样品无信号 |
待测样品含量低于测定的检测限 |
减小稀释倍数或浓缩样品 |
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目的物和缓冲液的相容性不好 |
确保样品储存缓冲液与待测样品相容性 |
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样品制备不正确 |
参考样品制备指南并规范保存 |
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样品保存时间过久或反复冻融 |
按一次使用量分装并规范保存 |
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变异系数 (CV) 较大 |
显色时在孔中形成沉淀 |
增大样品的稀释倍数 |
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酶标板不干净 |
实验时勿碰触酶标板底部 |
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孔中有气泡 |
确保酶标板读数时孔中无气泡 |
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板孔洗涤不均 |
检查洗板机的管口是否畅通 |
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试剂未混匀 |
所有试剂已充分混合 |
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移液量不一致 |
使用校准好的移液器和正确的移液方法 |
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标准曲线信号弱 |
标准品复溶不当 |
开盖前短暂离心冻干标准品管；检查是否溶解完全 |
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标准品已降解 |
按推荐方式保存标准品 |
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移液体积出错或不准 |
使用校准好的移液器和正确的移液方法 |
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试剂盒过期 |
不使用过期产品 |
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试剂盒保存不当 |
按说明书要求保存各组分 |
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板孔过分干燥 |
检测及加样过程不可中断。尤其洗板之后，需及时加入试剂。孵育时，贴覆膜。 |
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酶反应显色慢 |
每次使用前将整瓶TMB显色底物在37°C平衡30min。延长孵育时间 |
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酶标仪波长不正确 |
核实波长并重新读取OD450值 |
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板孔清洗过度 |
按说明书描述的洗板次数 |
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背景高 |
未彻底洗涤 |
按说明书描述的洗板次数 |
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洗涤缓冲液受污染 |
洗涤液现用现配，手工洗板悬空加洗液，不触及板孔 |
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检测试剂过多，或配置浓度过高 |
使用校准好的移液器和正确的移液方法 |
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终止后读数不及时 |
加入终止液后立即读数 |
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TMB底物孵育在强光下进行 |
显色时避光孵育 |
TOP1：标曲显色过强无明显梯度
1、主要怀疑点：洗板不充分：
1.1、机器洗版：确保机器设置的针头能吸干孔中液体，并且加液针头能加液大于350ul，加液针头没有被异物或者结晶盐堵住。
1.2、手动洗板，严格按照步骤，使用干净灭菌的枪头和加样槽，使用无氧化剂的吸水纸。加350ul洗液，静置90秒，在吸水纸上拍干孔中液体后再加入下一步洗液或者试剂。
1.3、特别注意，在加入TMB前的洗板步骤极其重要，残留的HRP酶会直接导致TMB显色。
2、次要怀疑点：
2.1、TMB 已经污染，检测TMB是否透明无色，如果偏蓝就是污染了。
2.2、检查配制洗液的水是否污染，要求使用的水是双蒸水，三蒸水或无离子水，水中的Fe3+,Cu3+,Co3+等过渡金属，以及HClO都会氧化TMB。
2.3、酶标板受潮，长霉，或者试剂过期。
2.4、环境污染，空气中有导致显色的物质或者粉尘。
Top2：显色较弱或不显色，没有说明书提供的数据阳性强
可能原因分析：
1、检查标准品是否受潮或者拿错
2、检查试剂是否按照说明书中要求的保存条件保存，特别是浓缩检测抗体和浓缩SABC， 如果放在-20度，融化后会严重影响其活性。
3、移液器是否校准，可以用去离子水较准移液器，1000ul=1.0g 100ul=0.1g 10ul=10mg
4、37度培养箱是否校准温度（建议用水银温度计放入水杯中，平衡12小时以上进行测量）。
5、SABC工作液和TMB在孵育前进行37度平衡半小时。
6、未严格按照说明书纸质版提供的方法操作。
7、试剂盒过期。
Top3：复孔做的不好，CV值差异大
可能原因分析：
1、复孔OD450数值在0.5-2.5之间计算的偏差相对较小，小于0.5会由于操作误差导致计算的CV值偏高，复孔样品数量在5-10个最佳。
2、操作时按照标准动作进行加样，比如要求枪头不能碰触到孔壁内侧和底面，枪头尖部的残留液体可以触碰到液面，使之流入样品孔。
3、加样尽量快速准确，不要产生气泡。
4、样品需要做预实验，使用不同浓度进行测试，找到最佳稀释比。错误的稀释比会导致复孔误差大
Top4：显色太快，背景小于0.2，但是样品没有阳性。试剂盒工作正常，但是样品没有阳性。
可能原因分析：
1、样品是否保存妥当。蛋白容易降解，最好保存在-80℃，或者新鲜样品立即检测。
2、样品含有的基质影响抗原抗体结合，导致没有阳性。需要适当稀释样品 1/5，1/10，1/100，1/1000来摸索最佳检测稀释比，稀释液稀释样品后会消弱基质效应，阳性就会升高。
3、部分试剂盒要求4度过夜孵育样品和标准品，如果样品稀释后还是检测不到阳性，建议4度16小时孵育标准品和样品，其它步骤在按照说明书提供的温度和时间进行操作。
4、如果是特殊的样品，请通过邮件与我们技术支持进行联系。
TOP5：稀释过的样本OD 值比没有稀释的样本值高些
1、血清有基质效应，会导致试剂盒回收率下降。所以用原液检测数值会低于稀释后的数据。
2、FineTest®ELISA试剂盒提供的稀释液有抗基质成分，说明书要求样品至少稀释1倍以上
3、血清的基质的一类异嗜性抗体或者溶血后的物质，这些物质会封闭捕获抗体，导致抗体无法结合样品中的蛋白，当稀释后 这类物质效应下降，回收率就升高。
Top6：标曲方程选择问题
一般我们选择曲线平滑上升或者下降，所有点都在曲线上，R值接近于1的方程