IF实验步骤
一、样本处理
1、细胞样本
1.1、洗涤：弃去培养基，在细胞上缓慢加入常温TBS，清洗2次，每次5秒。
1.2、细胞固定：在细胞上覆盖 4%中性甲醛固定液（TBS缓冲液配制），置于4℃，固定15min；固定液需足量。
1.3、固定液的清洗：去除固定液，使用4℃预冷的TBS缓冲液，漂洗3次，每次5分钟。
1.4、通透（可选）：加入TBS缓冲液配制的0.3% Triton X-100室温孵育10min，TBS漂洗3次，每次5分钟（靶点在细胞外的膜蛋白可省略细胞通透步骤）。
注意：需避免实验操作时温差过大或温度骤变；固定液需保证足量，可过量使用；甲醛有毒性，加固定液和固定后的清洗需在通风橱内操作。
2、石蜡切片样本
2.1、烤片：石蜡切片置 60℃烘箱中1h，融化掉组织周围石蜡，使组织紧贴载玻片。
2.2、脱蜡水化：
①二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，各浸泡10min。
②乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，各浸泡5min。
③蒸馏水洗5min。
2.3抗原修复：根据待检测的抗原，选择EDTA或柠檬酸抗原修复液。
抗原微波修复：用塑料切片架，置于染片缸内，EDTA修复液淹没切片，选择高档（功率100%）5min，取出室温放置2min，再放回微波炉低档（功率10%）5min，取出染片缸，保持切片浸没在修复液中，室温自然冷却约30min。取出切片，用PBS浸洗1min×3次。
抗原修复的注意事项：
① 组织切片保持湿润状态。
② 选择抗原修复方法要因抗体而异。
③ 抗原修复完成后避免快速冷却。
3、冰冻切片样本
3.1、样本在OCT包埋液中速冻。
3.2、冰冻组织固定在切片组件上，切片收集，切片厚度为10-20μm.
3.3、擦去多余OCT, 用组化笔勾画组织疏水边界。
注意：切片晾干10-15min, 防止切片在后续洗涤步骤脱片。
二、染色步骤
1、封闭：用5%空白山羊血清将样本完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于37℃恒温培养箱孵育30min。
2、一抗孵育：去除封闭液，直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液，样本需完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于4℃孵育过夜。
3、复温：将样本置于常温，复温15min，去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟。
4、二抗孵育：在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时；去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟。
5、染核：在样本上滴加DAPI工作液，DAPI粉末用蒸馏水配置成1mg/ml，使用时用0.01M pH7.2 TBS缓冲液稀释成0.5-10μg/ml，避光室温孵育10分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟。
6、滴加抗荧光衰减封片剂后，加盖玻片封片，于荧光显微镜下观察并采集图像；
注意：实验中，所有试剂滴加应准确、快速、足量，不能出现干片的情况；染色步骤从二抗孵育开始，后续所有步骤都需注意避光操作；染色完成后需及时观察并采集图像，避免干燥和荧光物质淬灭。