WB 实验步骤
一、样本制备
1、细胞收集
1.1、贴壁培养细胞收集：去除贴壁细胞的培养液，用预冷 PBS 清洗细胞 2 次，吸出 PBS。
1.2、悬浮培养细胞收集：先 3000 转/min 离心 5 分钟收集细胞沉淀，再用预冷 PBS 轻轻吹打重悬，离心收集细胞沉淀。
1.3、组织样本收集：用干净的医用剪剪碎目标组织，使组织块尽量小，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止样品被蛋白酶降解。将组织用液氮或超低温冰箱中冷冻 30min，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在 1-2min 之内，以减少蛋白的降解。
2、总蛋白提取
2.1、细胞/组织裂解：对于细胞样本，加入预冷的 RIPA 裂解缓冲液(含有 PMSF)（每 107 细胞/100 mm 培养皿/150cm2 培养瓶加入 1ml；每 5×106 细胞/60 mm 培养皿/75cm2 培养瓶加 0.5ml），冰上裂解 15min。
对于组织样本，按照 1mL 裂解液/100mg 组织向匀浆器中加入蛋白裂解液，多次匀浆，直至组织完全匀浆，收集匀浆液。（裂解液中根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂）。
2.2、离心
把裂解好的样本置于于预冷的高速冷冻离心机中，12000rpm，10min。
2.3、蛋白变性
离心完成后，弃去沉淀，保存上清。吸取 10μl 蛋白上清做蛋白浓度（BCA 法）测定。向剩余的蛋白提取液的离心管中加 5×Loading Buffer（最终工作液为 1X)，95℃加热变性 5min，待液体完全冷却后置于-20℃分装保存，避免反复冻融。
二、凝胶电泳
1、制胶及上样：
1.1、配制分离胶，根据蛋白大小，选择不同浓度的分离胶（见下表）混匀后注入预先按照好的制胶器中，其上加一薄层异丙醇封胶，室温水平静置 30min 至凝固。聚合后，可见在顶层异丙醇与凝胶的界面间有一清晰的折光线。注意：防止气泡注入；注胶前加入 TEMED,防止注胶前凝固；注入异丙醇时需沿玻板一边缓慢拖动加入。
1.2、待分离胶凝固后，倾去其上的异丙醇，以吸水纸吸净残余液体，缓缓加入配制好的浓缩胶至玻璃平板夹层， 将样品梳沿玻板一端缓慢插入夹层的浓缩胶液体中，必要时，再补加浓缩胶液体充盈剩余空间。室温水平静置 30min， 待胶完全聚合，凝胶时间视温度而定。注意样品梳与胶溶液间避免产生气泡。
1.3、将凝胶固定于电泳装置上，内槽加满电泳缓冲液，外槽没过底部 3-5cm 即可。双手垂直拔出样品梳。
1.4、用移液枪吸取样品垂直梳孔上样。成分很复杂的蛋白质混合物需加 100～200µg，而成分较少的样本只需 1-50µg 蛋白量。对照孔加入蛋白质分子量标准品，如有空置的加样孔，须加等体积的空白 1×Loading Buffer，以防相邻泳道样品的扩散。
分离胶浓度的选择：
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分子量（ kDa） |
分离胶浓度 |
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X≤10 |
15% |
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10<X≤15 |
13.5% |
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15<X≤25 |
12% |
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25<X≤35 |
11% |
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35<X≤40 |
10% |
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40<X≤55 |
9% |
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55<X≤70 |
8% |
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70<X≤100 |
7% |
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100<X |
6% |
2、电泳（采用恒压）
2.1、接通凝胶电泳仪的电源，先在 80V 下电泳至溴酚蓝染料从浓缩胶进入分离胶。（约 30 分钟）
2.2、提高电压至 120V，继续电泳直至溴酚蓝到达凝胶底部为止。
三、转膜
1、从玻璃板中取出凝胶，在凝胶的一角切去一小块以便在染色及干胶后仍能认出加样次序，将其浸泡于转移缓冲液中。
2、取与胶同样大小的 NC 或 PVDF 膜，NC 膜用转移缓冲液浸泡 5 分钟以上待用，PVDF 膜需要先放入甲醇中浸泡5-10 分钟，再放入转移缓冲液浸泡。
注意：目的蛋白分子量大于 20kDa 选择 0.45μm 的NC 膜，小于 20kDa 选择 0.2μm 的NC 膜或 0.22μm 的PVDF 膜。
3、按从负极到正极顺序在转移夹内依次放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、三层滤纸、凝胶、膜、三层滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。
4、将转移夹放入预先加满转移缓冲液的转移槽中，膜在正极、胶在负极，整个转移槽放置入冰水浴中，按照下表条件进行电泳。
注意：事先裁剪滤纸和膜，1 张膜和 6 张滤纸。靠膜一侧滤纸可裁剪稍小些，以防与另一侧滤纸边缘连接形成短路。转膜条件的选择：
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分子量（ kDa） |
转膜条件 |
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X≤10 |
恒流 200mA, 30min |
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10<X≤15 |
恒流 200mA, 40min |
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15<X≤20 |
恒流 200mA, 50min |
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20<X≤50 |
恒流 200mA, 1kDa/min+20min |
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50<X≤100 |
恒流 200mA, 1kDa/min+30min |
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100<X≤150 |
恒流 250mA, 1kDa/min+20min |
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150<X≤180 |
恒流 270mA,1kDa/min |
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180<X |
恒流 270mA,1kDa/min |
四、封闭
把膜取出后放入合适孵育容器中，加入 5%脱脂奶粉/TBST，室温摇动孵育 1 小时。
五、抗体孵育
1、一抗孵育：直接将一抗加入封闭液中进行适当稀释，室温 2h 或 4℃振摇孵育过夜；
2、以 TBST 洗膜，5 分钟 x 4 次；
3、二抗孵育：二抗用 TBST 稀释，室温下振摇孵育 1h；
4、以 TBST 洗膜，5 分钟 x 4 次。
注意：清洗换液过程中应避免膜干掉，否则会产生非特异背景。
六、曝光
1、根据膜的大小，按每 10cm2 膜使用 1-2ml 工作液，将 ECL 试剂盒中的 A、B 组分按 1：1 的比例混合，配置成发光检测工作液。
2、用镊子取出膜，膜下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余液体，将工作液加到膜上，室温孵育 1-2min，此步骤可在洁净保鲜膜上完成。
3、压片检测：将膜固定于片夹内，暗室压片 1 分钟，立即显影定影，根据结果调整压片时间，或直接分别压片 30s、1min、3min、5min，然后一起显影定影观察结果。
4、荧光成像仪检测：将膜放到荧光成像仪内，参考仪器说明书进行检测。