解析EGFR：从结构功能到WB实验要点

EGFR（表皮生长因子受体）是HER家族成员之一，广泛分布于多种细胞表面，调控细胞生长、增殖和分化。EGFR突变或过表达与肿瘤密切相关。作为一种糖蛋白，EGFR通过与配体如EGF和TNF-α结合激活信号通路，并可能与其他ErbB受体成员协同作用。近年来，针对EGFR的小分子抑制剂、单抗、双抗和ADC研究不断进展，但耐药性问题也逐渐显现。

一、EGFR结构

EGFR基因位于人类7号染色体的短臂，包含28个外显子，编码分子量为170kDa的酪氨酸激酶受体，属于ErbB家族。该受体由胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域组成。配体如EGF或TNF-α结合后，EGFR形成同源或异源二聚体，激活其酪氨酸激酶活性，启动自磷酸化反应，并激活下游信号通路，如RAS/MAPK、PI3K/AKT等，调控细胞增殖、分化及存活等过程。EGFR在多种肿瘤细胞中普遍表达。

二、EGFR信号通路 

EGFR激活后，启动多个下游信号通路，包括Ras/Raf/MEK/ERK1/2、JAK/STAT和PI3K/Akt途径，分别调控细胞增殖、细胞周期、存活和抑制凋亡。EGFR的酪氨酸激酶活性可受到EGFR基因突变、基因拷贝数增加和过度表达等致癌因素的影响。此外，EGFR与整合素途径相互作用，激活基质金属蛋白酶，改变细胞粘附，促进肿瘤细胞的运动、侵袭和转移，推动肿瘤进展。

三、EGFR WB实验

1.样本制备：

EGFR作为跨膜蛋白，提取时建议使用SDS或强RIPA裂解液，配合超声处理以确保蛋白充分溶解。选择研究样本时，需确认EGFR的表达量，虽然肿瘤细胞普遍表达，但存在差异。若不确定，可使用A431细胞作为高表达对照，或用HeLa细胞替代。此外，制样时应加入足量的还原剂（如DTT或BME）打断二硫键，以确保EGFR的有效提取与分析。DTT或BME不稳定，使用时需及时补充。

2.抗体选择：

研究EGFR的磷酸化至关重要，因为在发现信号肽之前，首先报道了EGFR的磷酸化位点及其对应的氨基酸。后来才发现N端有24个氨基酸的信号肽，该信号肽在EGFR运输到膜后被酶切掉。为了保持一致性，研究界通常以最初报道的磷酸化位点为准，这也解释了磷酸化位点的差异。因此，在查找相关抗体时，我们应根据Uniprot的磷酸化位点减去24个氨基酸来查询。

3.细胞定位：

EGFR通常定位于细胞膜表面，但在特定条件下，它可以通过内吞机制转运至细胞核，激活转录活性。在进行WB实验时，可以保留核蛋白或尽量完全裂解全细胞蛋白。做免疫荧光定位实验时，如果在细胞核内发现EGFR的阳性染色，不应立即认为是非特异性染色，这可能是EGFR入核的表现。核内EGFR的存在被认为是EGFR抑制剂耐药性的重要原因之一。

世上道理千差万别，每个人的理解与实践各有不同，在EGFR相关研究中，蛋白的表达丰度、抗体的识别位点及实验流程的细节，都会影响WB实验的成功与否。菲恩生物拥有十余年实验经验和专业技术团队，专注于为您的EGFR相关研究提供高质量支持，助力科研顺利推进。

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