流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种高效的分析方法，能够对细胞悬液中的单个细胞进行快速分析和收集。FCM的主要优势包括速度快、结果客观，并且具备显著的统计意义。它能够处理复杂样本，同时收集多个参数，确保结果的可靠性和重复性。通过流式细胞术，研究人员可以深入分析细胞的特性、状态和相互作用。对于对流式细胞术的原理和步骤不太了解的同学，建议先阅读我们公众号之前的文章，以便更好地理解相关背景知识。今天，我们将总结并分享一系列关于流式细胞技术的常见问题及其分析。
1. 荧光抗体染色无信号或信号弱
抗体量不足：适当增加抗体的量或浓度，以提升信号强度。
细胞数量过多：调整细胞密度，确保细胞数量适中，通常应低于1×107个/ml。
抗体储存不当：将抗体在4℃冷藏并避光保存，避免冻存导致沉淀，从而影响染色效果。
荧光染料分子量过大：选择适合的分子量染料，以确保其能够顺利进入细胞。
一抗和二抗不匹配：确保二抗是抗一抗来源物种。
仪器故障：检查流式细胞仪的光学系统，包括激光器、滤光片和检测器是否正常，以确保信号检测不受影响。
靶蛋白不存在或表达水平低：确认靶蛋白的存在并确保其表达量足够。
靶蛋白的表达位置及诱导问题：确认靶蛋白的表达位置，并确定是否需要诱导才能有效表达。
分泌蛋白检测困难：对于分泌蛋白，使用高尔基体阻断剂以保持蛋白在细胞内，便于染色检测。
补偿设置过高：通过设置合适的阳性对照，调整流式细胞仪的参数，以避免过高的补偿影响信号检测。
| 对照物 | 所含物质 | 目的 | 说明 |
| 未染色对照 | 经过完全处理而未添加任何抗体的细胞。 | 用于检测自发荧光，也可用作额外的阴性对照 | 与微珠相比，有助于确定自发荧光的相对量。如果自发荧光水平过高，可考虑使用不同的激发光源。 |
| 内部阴性对照 | 不表达目标抗原目经过完全处理的细胞群。 | 用于避免非特异性结合产生的假阳性结果。 | 有时候获得阴性对照细胞并不容易。理想情况下，内部对照的荧光强度应与未染色对照一致。 |
| 同型对照 | 与同型对照抗体一同培养的细胞(细胞中不应包含由某种抗原产生的抗体)。 | 用于检测一抗的非特异性结合。 | 同型对照至少应与一抗或二抗的重链（lgA、lgG、lgD、lgE 或lgM)匹配，并且可与相同的荧光团偶联。 |
| 二抗对照 | 仅用二抗培养的细胞。 | 用于检测二抗的非特异性结合。 | 仅当使用二抗时需要 |
| 阳性对照 | 表达所关注靶标的细胞。 | 用于避免错误抗体产生的假阴性结果。 | 有时候获得阳性对照细胞并不容易 |
2. 荧光强度过高
抗体浓度过高：减少荧光抗体的使用量或稀释倍数，以降低信号强度。
补偿不当：检查补偿设置，确保每种荧光染料的信号正确补偿，以避免信号重叠。
仪器设置问题：检查流式细胞仪的激光强度和增益设置，调整为合适水平以避免过度饱和。
靶标非特异性结合：优化洗涤步骤，以减少非特异性结合的影响。
细胞聚集：确保细胞在染色和分析过程中没有聚集，聚集会导致信号增强。
3. 应该只有一个细胞群的情况下观察到多个细胞群
染色不均匀：不均匀的抗体染色可能导致细胞表现出不同的荧光强度，形成多个群体。
有多个细胞群：样品本身可能含有多个表达靶蛋白的细胞群，但在操作过程中未能有效分离。
出现细胞双峰：可能观察到第一群细胞的荧光强度是第二群的两倍。这通常是由于细胞分离不充分，或者细胞团块未被过滤，导致在检测时多个细胞聚集在一起。
4. 背景高或阳性细胞百分比高
在流式细胞技术中，常见的问题之一是抗体使用过量或补偿不足。当使用多种荧光标记抗体进行染色时，不同荧光染料的发射谱可能会重叠，从而导致荧光溢漏现象。这意味着某些荧光信号会错误地被检测到其他通道中，影响结果的准确性。如果补偿设置过低，就无法有效纠正这些溢漏的信号，导致背景信号升高，并可能影响阳性细胞的准确识别及其百分比的计算。
5. 侧向散射（反映细胞的颗粒度）背景高
细胞裂解过度：在样品制备过程中，过度离心或振荡可能导致细胞破碎，从而产生细胞碎片。
细菌污染：为了从其他微小颗粒和背景信号中区分细菌群落，可以通过用荧光染料标记细菌，利用该荧光来识别目标群落。
死细胞的处理：流式细胞术容易受到死细胞的干扰，因为死细胞比活细胞更容易摄取抗体和探针，导致显著的非特异性染色。此外，死细胞通常具有较强的自发荧光，增加背景荧光，从而影响对某些靶蛋白弱阳性表达的观察。
6. 对照设计不合理，出现假阳性或假阴性结果
分析：流式实验需要设计多种实验对照，包括：
生物学对照：用于验证实验结果的生物学相关性。
空白对照：为了排除样本自带的荧光背景，设置空白对照以验证各个检测通道的信号是否为阴性。
同型对照（Isotype control）：由于一些免疫细胞表面存在Fc受体，为了评估抗体Fc段与靶细胞的结合情况，需要引入同型对照。在免疫细胞的流式检测中，通常要添加Fc受体封闭剂，然后再加入目标抗体的同型对照，以排除Fc受体造成的假阳性结果。
补偿对照（单阳性对照）：当荧光染料之间的发射光谱重叠时，信号可能扩散到多个通道，补偿是校正这种溢漏的过程。补偿实验需要每种荧光染料的单染样品（每个样品只染一种染料）。设置补偿对照时需遵循四个基本原则：
补偿荧光染料必须与实验荧光染料完全匹配。
补偿对照的亮度需与实验样品相同或更高。
对于任何对照，阴性和阳性群体的自发荧光应相同，最好为每个通道的阳性和阴性群体单独设门，避免使用通用阴性对照。
补偿依赖于荧光强度中位值的准确计算，因此需收集足够多的事件（建议超过5000个）。
荧光减一对照（Fluorescence Minus One，FMO）：正确设门是分析流式细胞术数据的关键。当细胞群体不易界定或较为稀少时，FMO对照能帮助准确评估背景，从而在多色实验中可靠地区分阴性和阳性细胞群体。
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| 流式抗体推荐 | |||
| 种属 | 细胞群 | 流式抗体搭配 | 货号 |
| Human | T/B/NK细胞群检测 | CD45-PerCP | PCP-30039 |
| CD3-FITC | FITC-30004 | ||
| CD16-PE | PE-30061 | ||
| CD56-PE | PE-30008 | ||
| CD19-APC | APC-30066 | ||
| Human | Th1/Th2 细胞群检测 | CD3-PerCP/Cyanine5.5 | PCP55-30004 |
| CD4-FITC | FITC-30005 | ||
| IFN-γ-PE | PE-30053 | ||
| IL4-APC | APC-30043 | ||
| Mouse | Th1/Th2 细胞群检测 | CD3-PerCP/Cyanine5.5 | PCP55-30002 |
| CD4-FITC | FITC-30001 | ||
| IFN-γ-PE | PE-30074 | ||
| IL4-APC | APC-30026 | ||
| Human | Treg细胞群检测 | CD4-FITC | FITC-30005 |
| CD25-PE | PE-30035 | ||
| CD127-APC | APC-30033 | ||
| Mouse | Treg细胞群检测 | CD4-FITC | FITC-30001 |
| CD25-PE | PE-30017 | ||
| FOXP3-APC | APC-30055 | ||
| 同型对照抗体推荐 | ||||
| 货号 | 产品名称 | 宿主 | 标记物 | 规格 |
| FITC-30073 | FITC Rat IgG2a,κ Isotype Control(2A3) | Rat | FITC | 20T/100T |
| PE-30073 | PE Rat IgG2a,κ Isotype Control(2A3) | Rat | PE | 20T/100T |
| APC-30073 | APC Rat IgG2a,κ Isotype Control(2A3) | Rat | APC | 20T/100T |
| PE-30075 | PE Rat IgG1,κ Isotype Control(HRPN) | Rat | PE | 20T/100T |
| APC-30075 | APC Rat IgG1,κ Isotype Control(HRPN) | Rat | APC | 20T/100T |
| FITC-30076 | FITC Mouse IgG1,κ Isotype Control(MOPC-21) | Mouse | FITC | 20T/100T |
| PE-30076 | PE Mouse IgG1,κ Isotype Control(MOPC-21) | Mouse | PE | 20T/100T |
| PCP-30076 | PerCP Mouse IgG1,κ Isotype Control(MOPC-21) | Mouse | PerCP | 20T/100T |
| FITC-30077 | FITC Mouse IgG2a,κ Isotype Control(C1.18.4) | Mouse | FITC | 20T/100T |
| PE-30077 | PE Mouse IgG2a,κ Isotype Control(C1.18.4) | Mouse | PE | 20T/100T |
| APC-30077 | APC Mouse IgG2a,κ Isotype Control(C1.18.4) | Mouse | APC | 20T/100T |
| FITC-30078 | FITC Mouse IgG2b,κ Isotype Control(MPC-11) | Mouse | FITC | 20T/100T |
| APC-30078 | APC Mouse IgG2b,κ Isotype Control(MPC-11) | Mouse | APC | 20T/100T |