流式实验避坑指南 | 流式Panel设计5大核心原则

流式Panel的设计是流式实验的关键，决定了实验结果的质量。细胞表面抗原、抗体选择、荧光素标记及其他试剂的搭配，对实验结果的精准度起着至关重要的作用。随着技术的进步，现代流式细胞仪器可同时检测40多个参数，为科研人员提供了更深入分析复杂问题的可能，尤其在珍贵样本研究中，合理的Panel设计能帮助获得更丰富的数据，推动研究的深入开展。

一、了解待检测的指标

在设计任何流式Panel时，了解待检测细胞的标记分子（marker）至关重要。在实验前，需要明确所研究细胞的相关marker，并确定其标记与检测方法。需要特别注意的是，同一细胞在不同物种（如人类与小鼠）中的检测marker可能不同。建议首先参考相关文献，此外，OMIPs、BioLegend官网及CD分子等资源也可作为设计Panel的参考，帮助确保实验的准确性与可重复性。

二、对抗原表达量进行分类

抗原的表达量通常分为低表达（low）、中等表达（medium）和高表达（high）。此外，根据表达模式，还可以将其划分为以下三个等级（见表格）。

三、了解平台仪器的配置

目前的流式细胞仪包括传统流式、光谱流式和质谱流式。虽然这些仪器在Panel设计上遵循相似的思路，但数据读取方式有所不同。传统流式细胞仪通过二向色镜和滤光片组合接收荧光信号，但荧光素的发射光谱通常会有交叉，导致荧光溢漏。因此，进行多色实验时需要准备单染管来计算荧光溢漏比例。

光谱流式细胞仪能够收集荧光素的全光谱特征，每种荧光素都有独特的光谱特性，类似指纹。通过解析这些光谱，光谱流式可以有效区分不同荧光素，从而提高多色实验的精确度。

质谱流式则通过稳定同位素标记细胞，利用飞行时间质谱（TOF-MS）检测离子质量比。

四、荧光素的选择

根据仪器配置选择荧光抗体时，可以通过染色指数来判断荧光素的亮度。常见的荧光素可参考下表，而随着新染料的不断推出，选择的范围也越来越广泛。例如，BD新推出的RealBlue和RealYellow系列荧光素，提供了更广泛的选择，实际可用的荧光素种类远超过参考表格中的示例。

五、将抗原及荧光素进行配色

配色时应遵循几个基本原则：首先，强弱搭配原则，即将高表达marker分配给低亮度荧光素，低表达或未知表达量的marker分配给高亮度荧光素。同时，要考虑荧光素的特性，如某些荧光素容易淬灭，不适用于固定破膜的marker。对于共表达的marker，选择spillover较低的染料对，以避免扩散误差。互斥表达的marker可使用干扰较大的荧光素组合，只要不会产生实际干扰。对于溢漏较大的荧光素，应分配给低表达或仅在特定细胞类型中表达的marker。对于组织样品，最好使用死活染料。

六、上机测试多色panel

在正式上机前，需注意以下事项：首先，抗体滴定非常重要，厂家推荐的浓度仅供参考，实际使用时应通过滴定找到最佳浓度，具体可参考之前的文章。其次，选择合适的对照尤为关键，特别是补偿单染管对照和FMO对照。补偿对照的注意事项可参考前文，以确保实验结果的准确性和可靠性。

如果你觉得配色方案过于复杂，可以在购买抗体时直接向公司技术支持请求帮助，我们可以为你提供配色建议。菲恩生物还提供免费的配色方案、实验指导和数据分析服务，致力于提升科研工作的效率与精准度。

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