流式细胞术非特异性抗体结合7大原因

在流式细胞术实验中，非特异性结合是影响结果准确性的关键因素。高非特异性不仅会导致假阳性信号的产生，还可能掩盖真实的生物标志物。因此，了解非特异性的来源及其影响显得尤为重要。通过优化实验条件、选择合适的抗体和使用严格的对照，可以有效减少非特异性，提高数据的可靠性，从而为后续的生物学研究和临床应用奠定坚实基础。

在排查非特异性抗体结合之前，首先需了解抗体的结合方式。如图所示（A-F），A与非目标抗原结合，B与Fc受体结合，C与目标抗原结合但表位不正确。D-F则显示偶联的荧光染料与非目标抗原、Fc受体和目标抗原的结合情况。图G-I中，G与共享的抗原表位结合，H与Fc受体结合，而I则同时与目标抗原及其表位结合，形成特异性抗体。

下面分析非特异性抗体结合原因：

1.抗体使用过量

过量抗体会与低亲和力的非目标靶标结合，降低信噪比。建议按照说明书推荐的用量进行滴定，以确定最佳浓度。此外，抗体孵育时间应适度，参考厂家建议并根据实验情况进行调整。

2.非特异性黏附

所有细胞都能不同程度地黏附蛋白，抗体作为一种蛋白也会通过非特异性相互作用与细胞结合。为减少这种结合，可以在洗涤液和染色液中添加适量的胎牛血清（FBS）或牛血清白蛋白（BSA）。

3.排查是否抗体与Fc受体发生了结合

Fc受体是免疫细胞表面的抗体结合蛋白，部分细胞（如单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和B细胞）表面表达Fc受体。在流式实验中使用的抗体通常含有Fc段，因此在抗体染色过程中，Fc段可能与细胞表面的Fc受体结合，从而导致非特异性结合。

4.选择高特异性的抗体

抗体的交叉反应可能导致识别目标抗原表位以外的相似表位。菲恩生物流式抗体开发流程，确保了抗体的卓越性能和高特异性。该抗体对精细抗原表位具有出色的识别能力，为科研和临床研究提供了更高的灵敏度。

5.减少背景信号

Fc受体与抗体的结合是显而易见的，但较少人知的是，某些荧光染料也能结合Fc受体。例如，PE染料可以与小鼠的Fc-γ-RII（CD16）和Fc-γ-RIII（CD32）结合。此外，花青素染料（如Cy系列）及其相关串联染料（如PE-cy5、APC-cy7）也容易与Fc受体结合，特别是在使用FcR细胞（如单核细胞）时。这种结合无法通过Fc受体阻断剂抑制，因此建议避免使用花青素类荧光染料。

6.洗涤不充分

通过增加洗涤次数并使用合适的洗涤缓冲液，可以有效去除未结合的抗体，从而减少非特异性结合的影响。

7.存在死细胞

死细胞具有黏性，容易导致高非特异性结合，主要是由于其暴露的DNA。为排除死细胞，可以使用DNA结合染料（如7-AAD或PI）进行活死细胞鉴定。如果因荧光搭配问题无法添加活死染料，则可利用FSC/SSC散点图中的Viable门来帮助区分活细胞与死细胞。

在流式细胞实验中，选择合适的抗体和荧光染料、设置恰当的对照组以及优化实验步骤是确保成功的关键。菲恩生物提供多种适用于人、大鼠、小鼠等模型的流式细胞检测抗体，涵盖丰富的指标和灵活的选择。此外，菲恩生物还提供免费的配色方案、实验指导及数据分析服务，旨在为研究人员提供全面的流式细胞解决方案，助力科研工作高效、精准。

以下是菲恩生物推荐的流式抗体搭配方案