在生物化学与分子生物学的研究领域中，准确测定蛋白质浓度是确保实验成功的关键因素之一。由于蛋白质作为重要的生物大分子，具有种类多样、结构复杂以及分子量差异显著等特点，开发出一种通用或标准化的定量方法面临不少挑战。当前，存在多种用于蛋白质定量的技术，每种技术都有其独特的优势和局限性。因此，依据具体研究需求选择最适合的定量方法变得尤为关键。这不仅有助于提高实验结果的准确性，还能优化资源利用，促进科研工作的顺利进行。前面小编为大家介绍了几种常用测定蛋白浓度的方法，下面为大家讲其他常用方法。
1.双缩脲法(Biuret法)
双缩脲反应是指在强碱性环境下，双缩脲（由两分子脲经约180℃加热脱去一分子氨生成）与硫酸铜（CuSO4）反应形成紫色络合物的现象。此反应不仅限于双缩脲，凡含有两个酰胺基或肽键的化合物，包括多肽和某些蛋白质，都能发生类似反应。这是由于这些化合物能够与铜离子形成稳定的络合物，使得反应液呈现特有的紫色，成为检测相关基团存在的重要方法。
特点：双缩脲反应生成的紫色络合物颜色深浅与蛋白质含量成正比，适用于1-10mg蛋白质的测定，且不受蛋白质相对分子质量和氨基酸组成的影响。此方法快速、对不同蛋白质的颜色反应相近且干扰物质少，但灵敏度较低，适合不需要极高精确度的蛋白质定量。硫酸铵不影响该反应，有利于蛋白质纯化初期的检测。
然而，某些缓冲剂（如Tris）和氨基酸会干扰测定，且Cu²⁺易被还原产生红色沉淀。
实验步骤：
①试剂配制
标准蛋白质溶液：用结晶牛血清白蛋白（BSA）或酪蛋白配制成10mg/ml，BSA可用A280为0.66校正。牛血清白蛋白用H₂O或0.9% NaCl配制，酪蛋白用0.05M NaOH。双缩脲试剂：1.50g CuSO₄·5H₂O和6.0g酒石酸钾钠溶于500ml水，加入300ml 10% NaOH，定容至1L，存于塑料瓶中。
② 标准曲线
取12支试管，每组分别加入0-1.0ml标准蛋白质溶液，补足至1ml，加入4ml双缩脲试剂，室温放置30分钟，540nm比色。以未加蛋白的试管作空白对照。
③样品测定
同样方法测定未知样品，确保浓度不超过10mg/ml。取平均值绘制标准曲线，计算样品蛋白质浓度。
2.Lowry蛋白测定法(Folin-酚试剂法)
Lowry反应是双缩脲法的延伸，首先在碱性条件下形成铜-蛋白质复合物，其中肽键与铜离子结合。随后，Folin-酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，生成深蓝色的钼蓝和钨蓝混合物。该蓝色的深度与蛋白质含量成正比，从而实现蛋白质定量。此方法提高了检测灵敏度，适用于精确测定蛋白质浓度。
特点：Lowry反应具有更高的灵敏度，但操作复杂且耗时较长，需精确控制时间。其标准曲线非直线形式，专一性较差，多种物质如酚类、柠檬酸、Tris缓冲液等会干扰测定。尽管低浓度尿素、硫酸钠等不影响显色，高浓度时需校正。Folin-酚试剂在酸性条件下稳定，但还原反应需在pH=10下进行，加试剂后需立即混匀。此法适用于酪氨酸和色氨酸的定量，最低检测限为5mg，常用测定范围20~250mg。
反应步骤：
①标准曲线
取16支试管，1支空白，3支未知样品，其余分别加入0-1.0毫升250mg/ml标准蛋白溶液并补足至1ml。每管加5ml试剂甲，混匀后室温放置10分钟，再加0.5ml试剂乙并立即混匀，室温放置30分钟。于700nm比色，以未加蛋白的试管为对照，绘制标准曲线。
② 样品测定
取1ml样品（含蛋白质20-250μg），按上述步骤操作，用1ml蒸馏水作空白对照，同时测定样品和标准曲线。
③计算浓度
根据样品吸光度在标准曲线上查出蛋白质量，计算样品蛋白质浓度。
3.BCA蛋白测定法
BCA蛋白测定法基于双缩脲反应和比色检测原理。在碱性环境中，蛋白质中的肽键将Cu²⁺还原为Cu⁺。随后，BCA试剂中的二喹啉甲酸与Cu⁺螯合，生成一种紫色复合物。该复合物在562nm处有强吸收峰，且颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可通过比色法精确测定蛋白质含量。此方法灵敏度高、选择性好，适用于多种样品的蛋白质定量分析。
特点：BCA蛋白测定法操作简便，仅需一种试剂，在碱性溶液中比Folin试剂更稳定。优点是灵敏度高（检测下限10μg/ml，最小检测量0.2μg），对常见去污剂如SDS、Triton X-100和Tween有良好兼容性，线性范围广（20-1000μg/ml），且显色速度快。
然而，该方法易受EDTA、还原剂（如β-巯基乙醇）及半胱氨酸影响，建议样品中EDTA低于10mM，DTT和巯基乙醇低于1mM。
实验步骤：
①配制标准品
取20µl 5mg/ml BSA溶液，用PBS稀释至100µl（终浓度1.0 mg/ml）。
② 配制工作液
A液与B液按50:1混合，精准计算所需量（如测4样本3复孔共需7800µl A液和156µl B液）。
③加样
各孔加入标准品或样品（补足至20µl），再加入200µl工作液。
④ 孵育
混匀后37°C孵育30分钟或室温2小时。
⑤ 测吸光度
562nm下测吸光度，代入标准曲线计算蛋白质浓度。
蛋白浓度测定在生物化学研究中至关重要，不同方法各有优劣，需依据样品特性选择合适方案，注意标准曲线制备、样品稀释及干扰物质排除。菲恩生物提供强大的表达系统，利用大肠杆菌高效表达超3000种蛋白质，并通过独创的IF2DI标签提升溶解性和表达量。真核系统可快速生产活性蛋白，助力您的科研更具竞争力。
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