流式实验实体组织单细胞悬液制备方法

流式细胞术广泛应用于细胞表型和功能研究，而实验结果的可靠性往往取决于样品准备质量，尤其是从组织中获得高质量单细胞悬液。制备过程中需精准控制酶解条件，避免细胞损伤。组织样本（如肿瘤或免疫器官）是获取单细胞的重要来源，高质量悬液是流式分析和分选的基础保障。

一、处理方法

单细胞悬液的制备常采用机械法和酶消化法。机械法通过剪切、研磨、过滤等物理方式解离组织，适用于脾脏、淋巴结等软组织，操作简便快捷。但对于结构致密或结缔组织丰富的样本，通常需联合酶消化以提高解离效果。机械法虽效率高，但易导致细胞损伤或解离不完全。

二、组织处理

组织制备应优选新鲜样本，避免冷冻保存以减少细胞损失。用剪刀或手术刀切碎组织，增大表面积以利于酶消化。常用酶包括Collagenase、Dispase、Hyaluronidase等，TrypLE优于Trypsin以保留膜抗原，辅以DNase I和EDTA防止细胞聚集。Accutase作为复合酶，兼具高细胞回收率和抗原保留优势。

三、时间与温度的精准控制

酶解过程中需合理控制温度和时间。多数酶在37°C活性最佳，但低温（如4°C）可降低细胞死亡，需适当延长孵育时间。消化时间应适中，避免过短导致细胞聚集，或过长引发细胞损伤。机械辅助如轨道摇床可加速组织解离，最终通过100 μm滤网去除未消化组织块，获得高质量单细胞悬液。

四、单细胞悬液评估

细胞活性检测常用台盼蓝染色法，显微镜下计数死细胞，存活率应高于80%。流式细胞术则可通过核酸染料识别碎片，结合活力染料（如碘化丙啶）准确评估死亡细胞比例。为去除碎片与聚集体，可使用Miltenyi或STEMCELL磁珠分选试剂盒清除死细胞和杂质；若样本含红细胞，需统一进行红细胞裂解处理，确保实验一致性。

五、其他注意事项

① 离心参数与操作

使用RCF而非RPM，活细胞推荐300–400 RCF，固定细胞可达900 RCF，过高RCP会损伤细胞。选用聚丙烯离心管，避免涡旋操作，采用温和吹打提高存活率。

② 特殊实验需求

磷酸化流式需添加磷酸酶抑制剂保护蛋白，RNA检测时使用RNase抑制剂防止RNA降解。

③冷冻保存与固定

冷冻细胞存活率低，仅为新鲜的54%，存活率降至33.6%。4%多聚甲醛可稳定细胞，但可能改变抗原构象，需预实验验证。

由于不同组织及物种之间的消化差异，单细胞悬液的制备方法需根据具体组织类型、酶的选择、消化时间和温度等因素进行优化。这些变量会直接影响最终的实验质量。因此，建议根据文献和实验经验进行相应的调整。FineTest为研究人员提供适用于人类、大鼠、小鼠等动物模型的流式细胞检测抗体，涵盖多种指标，方便灵活选择。菲恩生物还提供免费的配色方案、实验指导及数据分析服务，帮助提高科研效率和结果的精准度，确保实验顺利进行。

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